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标题 固定假丝酵母脂肪酶candida rugosa lipase
范文

    周蕊 邢炎华 王燕

    

    

    

    摘 ?????要:以壳聚糖-戊二醛(Chitosan-GA)为载体固定假丝酵母脂肪酶candida rugosa lipase(CRL)最高酶活可达240 μ·g-1。Chitosan-GA固定化酶循环使用4次后保留了20%左右的初始酶活力。固定化酶在水相中保存185 d后保留了40%以上初始酶活力。固定化酶在有机溶剂(正庚醇)中浸泡120 h后固定化酶酶活保留32.2%,而游离酶只保留原始酶活的8.5%。Chitosan-GA载体固定化脂肪酶在水相和有机相中的保存稳定性都好于游离酶。

    关 ?键 ?词:壳聚糖;假丝酵母;初始酶活力;固定化

    中图分类号:O629.8 ???????文献标识码: A ??????文章编号:1671-0460(2019)08-1686-04

    Abstract: Chitosan support was synthesized by coupling glutaraldehyde (Chitosan-GA) onto the surface. And then candida rugosa lipase(CRL) was immobilized on this support. The highest activity of immobilized lipase was 240 μ·g-1. The immobilized lipase remained 20% of initial activity even after 4 times of reuse. The drop in the activity of the immobilized lipase after 185 days storage at 4 ℃ did not exceed 60%. Immobilized enzyme is much more stable than free enzyme in aqueous phase and organic phase.Key words: Chitosan; Candida mycoderma; Initial enzyme activity; Immobilization

    固定化酶是用固體材料将酶束缚或限制于一定区域内,酶仍能进行其特有的催化反应,并可回收及重复使用的一类技术[1,2]。与游离酶相比,固定化酶具有更多优点[3]。

    酶的“柔性固定化”就是在固定化载体上,接上一些有足够长度的且是亲水的分子链,即所谓的“柔性链”,接有柔性链的柔性载体的引入,在制备固定化酶的过程中,当酶与柔性载体相碰撞结合时,就会因柔性链的缓冲作用,使酶保持构象不变以减少酶的活力损失;另外,在柔性固定化酶与底物作用时,被固定到柔性载体上的酶可以更好地保留酶游离态的均相催化活性,还能使酶蛋白构象因受微环境的改变而发生折叠、失活处于亚稳态时,当施加反折叠措施,酶恢复正常构态时,因柔性而位垒更低,更易于恢复,即可增加酶的自恢复能力,从而解决酶蛋白的不稳定性问题[2-6]。

    脂肪酶在有机溶剂中具有高的催化活性和立体选择性,因而已广泛应用于制备具有光学活性的醇、脂肪酸及其酯等纯手性医药和农药的中间体[7]。

    本文通过研究实现制备Chitosan-GA载体,固定化商品脂肪酶并优化固定条件;Chitosan-GA载体固定化实验室自产耐有机溶剂脂肪酶并优化固定条件。

    1 ?实验部分

    1.1 ?仪器与试剂

    细胞破碎仪,Biosafer 250-88,赛飞(中国)有限公司;恒温振荡器,THZ-82,北京国华仪器;真空干燥器,2K-82A,上海试验仪器总厂;磁力加热搅拌器,79-1,常州国华电器有限公司。

    壳聚糖,济南海得贝,冰醋酸、六偏磷酸钠、聚乙烯醇、正庚醇、环己烷、无水乙醇、丙酮、戊二醛均为国产分析纯。Candida rugosa脂肪酶:酶的稳定温度2~8 ℃,最佳反应温度为37 ℃,适于水解橄榄油等短链底物。

    1.2 ?固定化材料

    1.2.1 ?Chitosan-GA载体(Chi-GA)的制备

    根据文献[8]制备Chitosan(Chi)小球:将壳聚糖 5 g溶解于200 mL 8%的醋酸得到2.5%的壳聚糖的醋酸溶液,并加入20 mL氢氧化钠溶液(0.5 g·mL-1),将所得壳聚糖的醋酸溶液调至pH=6。注入1.5%的六偏磷酸钠溶液中,使壳聚糖液固化成小球,置换新鲜的六偏磷酸钠溶液浸泡一夜。取少量载体,经水洗,醇洗后水泵干燥,再真空干燥过夜。

    Chi-GA载体制备:取上述Chitosan小球3 g,加入到1 mL戊二醛(GA,25%)水溶液及15 mL乙醇(50%)水溶液中,70 ℃下反应24 h后,用热、冷水洗5遍,洗去过量的GA,置于磷酸缓冲液(pH=7,0.05 g·mL-1)中浸泡备用。

    1.2.2 ?固定化酶Chi-GA-CRL的制备

    通过改进文献[2,4,8]的方法,在锥形瓶中加入一定量固定化载体,加入一定量酶液和缓冲液,在一定温度下恒温振荡一定时间。固定化结束后,过滤,用蒸馏水洗涤至载体表面无残留游离酶,再用磷酸缓冲液洗涤,抽滤后测固定化酶活力[9-11]。

    1.3 ?酶活力测定

    1.3.1 ?试剂配制???缓冲液:0.05 g·mL-1磷酸缓冲液,pH=7;? 底物溶液:4%聚乙烯醇(PVA)溶液与橄榄油以体积比3:1混合,用细胞破碎仪超声30 min充分乳化均匀;终止液:乙醇和丙酮混和溶液(V:V=1:1);脂肪酶液:用缓冲液充分溶解脂肪酶粉(50 mg/mL);上清液:固定化后的酶液上清液。

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更新时间:2024/12/23 10:07:31