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HPLC法测定头孢他啶原料药及制剂中杂质头孢他啶叔丁酯的含量

范文

金燕燕

摘要：目的：探讨分析HPLC法测定头孢他啶原料药及制剂中杂质头孢他啶叔丁酯的含量。方法：应用高效液相色谱法，色谱柱C18，流动相分别为乙腈溶液和磷酸盐缓冲溶液，线性梯度洗脱，检测波长255nm。结果：头孢哌啶叔丁酯在0.01-1.22μg/mL范围内呈良好的线性关系，平均回收率为99.3%，相对标准偏差为1%。结论：现有生产工艺在生产头孢他啶药物时，所残留的CBE余量少，可以不需要进行控制。高效液相色谱法具备较强的专属性，检测结果准确，可以有效测定头孢他啶原料药、制剂中杂质头孢他啶叔丁酯含量。

关键词：HPLC法;头孢他啶原料药;制剂;杂质;头孢他啶叔丁酯

1 仪器与试剂

此次试验采用高效液相色谱仪，色谱柱为C18。CBE对照品，头孢他啶原料药，头孢他啶碳酸钠原料药，头孢他啶精氨酸原料药，注射用头孢他啶a，注射用头孢他啶b。乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯。

2 方法

2.1制备溶液

CBE对照品溶液制备：称取12.2mgCBE，放置于容量瓶（100ml）中，添加流动相A进行溶解，并稀释至刻度，获得对照品溶液。

供试品溶液：精密称取适量头孢他啶原料药，使用流动相A溶解，稀释为每1ml还有头孢他啶50mg的溶液。摇晃均匀后过滤，获得供试品溶液。

2.2色谱条件

色谱柱：C18。流动相：流动相A为乙腈-磷酸盐缓冲溶液（称取7.17g磷酸二氢铵加水溶液，稀释至1000ml，使用氨溶液调节pH值至7）=7：93。流动相B为乙腈-磷酸盐缓冲溶液=25：75。线性梯度洗脱，检测波长为255nm，流速为每分钟1ml，柱温为35℃，进样量为10μL。

3 结果

3.1專属性试验

选取五份头孢他啶原料药，置入不同容器中，开展光、酸、碱、高温、氧化等破坏试验。按照试验结果可知，本文所设置的色谱条件能够有效分离CBE和其他降解产物，并且和邻近杂质峰的分离度大于6，满足要求，说明破坏程度较弱。选取2.1试验条件，分析对照品溶液，供试品溶液，氧化，高温破坏试验溶液，结果如图1所示：

通过图1能够看出，破坏试验会增加样品的杂质与含量，然而在CBD峰前、峰后，没有产生新的杂质。由于头孢他啶对于酸、碱与光照的稳定比较强，因此没有列入到破坏试验色谱图中。通过专属性试验结果显示，色谱条件具备适用性。

3.2线性范围

精密量取0.5μL、1μL、2μL、5μL、10μL对照品溶液注入到液相色谱仪中，记录色谱图。以浓度作为自变量，峰面积作为因变量，建立线性回归方程Y=2.01×106X+2.44×103（r=0.999，n=5）。结果显示，头孢他啶叔丁酯对照品溶液在0.01-1.22μg/mL范围呈良好的线性关系。

3.3精密度试验

选取对照品溶液，连续进行6次进样，记录色谱图，计算峰面积的相对标准偏差为1%，精密度良好。

3.4回收率试验

各称取3份对照品，使用流动相A溶解并稀释为每毫升含有CBE0.08mg、0.10mg、0.12mg的溶液，将其作为对照储备液。另外称取10份头孢他啶原料药（约含500mg头孢他啶），将其置于量瓶（10ml）中，其中9份分别加入对照储备液1ml，按照外标法测定。结果显示，CBE平均回收率为99.3%，相对标准误差为1.1%（n=9）。另1份用流动相A溶解并稀释作为空白供试品溶液，按照上述色谱条件检测，结果显示，在CBE峰位置没有检测出色谱峰。

3.5定量限与检出限

选取6.11mg对照品，将其置入容量瓶（100ml）中，添加流动相A溶解并稀释到刻度，选取10μL、2μL、1μL、、0.2μL、0.1μL等不同剂量注入到液相色谱仪中，详细记录色谱图。按照色谱峰高以信噪比等于10，得出CBE定量限为6ng;以信噪比等于3，得出检出限为2ng。

3.6稳定性试验

将对照品溶液放置于室温下，在0h、1.5h、3h，4.5h，6h条件下进行检测，详细记录色谱仪，按照检测结果显示，峰面积相对标准差为0.2%，说明溶液在6小时内的稳定性显著。

3.7耐用性试验

选择两种不同的色谱注测定同一种样品溶液，测定结果的相对标准差低于1.5%，所以通过两种色谱注检测结果之间的差异不明显，说明此种检测方法具备良好的耐用性。

3.8样品中CBE含量测定

按照上述方法对不同生产批量的样品进行检测，并且和头孢他啶相关物质检测的，薄层色谱法检测结果进行比较。结果显示，薄层色谱法在样本中均未检测出CBE，高效液相色谱法检测，头孢他啶原料物的CBE含量为0.01%;检测头孢他啶碳酸钠原料物的含量为0.02%，检测头孢他啶精氨酸原料物的含量为0.01%，检测注射用头孢他啶a的含量为0.03%检测注射用头孢他啶b的含量为0.02%，通过检测结果能够看出，头孢他啶原料药和制剂中，采用薄层色谱法，没有检测出CBE，通过高效液相色谱法检测CBE的含量也比较少。说明现有生产工艺在生产头孢他啶药物时，所残留的CBE余量少，可以不需要进行控制。

4 讨论

头孢哌啶叔丁酯检测浓度线性范围为0.01-1.22μg/mL，平均回收率为99.3%，相对标准偏差为1%。选择检测波长，选取适量CBE对照品，使用流动相A进行溶解，在波长220nm-400nm范围内进行扫描，结果显示，在255nm波长位置存在最大吸收，因此选择高效液相色谱法的检测波长为255nm。

头孢他啶在色谱柱C18上容易洗脱，流动相中加入缓冲盐溶液，可以增加流动相的极性，相应延长头孢他定的保留时间。此次研究中，将乙腈-磷酸盐缓冲溶液作为流动相，按照色谱图显示结果，头孢他啶和邻近杂质峰没有有效分离，通过梯度洗脱方法，可以明显延长保留时间，有效分离头孢他啶与CBE、CBE与其他杂质峰。

综上所述，通过此次研究结果显示，说明现有生产工艺在生产头孢他啶药物时，所残留的CBE余量少，可以不需要进行控制。高效液相色谱法具备较强的专属性，检测结果准确，可以有效测定头孢他啶原料药、制剂中杂质头孢他啶叔丁酯含量。

参考文献：

[1]郭思维，李昕，徐兵，周广青，李元，邓阳，黄珺晨.HPLC法测定头孢他啶血浆药物浓度及临床应用[J].中国临床药理学杂志，2019，35（22）：2903-2906.

[2]王琰，姚尚辰，张培培，邹文博，李进，许明哲，胡昌勤.HPLC-DAD法同时测定注射用头孢他啶阿维巴坦钠复方制剂的含量[J].中国新药杂志，2019，28（05）：541-546.

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