5种芽孢杆菌对弧菌的抑制作用

2024.09.28

张建业　殷蕊　孙桂清　于清海　刘玉峰　何忠伟　宫春光

摘要：通过液态拮抗培养法，研究了在盐度30‰条件下1×104、1×105和1×106 cfu/mL浓度的地衣芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、枯草芽孢杆菌（B.licheniformis）、凝结芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）、多粘类芽孢杆菌（B.coagulans）和侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporu）对混合弧菌（Vibrio）的抑制作用，结果显示，5种芽孢杆菌对混合弧菌均具有显著的抑制作用（P<0.05），其中，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的抑制效果最佳。

关键词：芽孢杆菌;弧菌;抑制作用

近年来，牙鲆（Paralichthys olivaceus）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）和半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）等海水鱼类的养殖产业发展迅猛，而随着养殖规模的不断增大，养殖对象的病害问题也愈发严重，给养殖户造成了巨大损失[1]。多数弧菌作为条件致病菌广泛存在于海水养殖环境中，常常造成养殖对象病害频发，因此，有效降低养殖环境中的弧菌密度对减少病害、保障水产品安全意义重大。水体消毒剂如：含氯消毒剂、酚类消毒剂等的过度使用会对水产动物本身产生损伤[2]，长时间使用抗生素容易产生耐药性，同时抗生素还可通过水产品危害到人类健康[3]，减少或禁止化学试剂及抗生素的使用已经成为水产养殖行业的主要趋势[4]。针对此情况，采用益生菌制剂来抑制病原菌、净化养殖水体，已成为解决此类问题的重要手段之一[5]。芽孢杆菌是一类广盐性菌群，生长受盐度影响较小，在海淡水中均可生长繁殖，能够应用于海水养殖[6]。近年来，越来越多的研究表明芽孢杆菌可以解决长期或过量使用抗生素对水生动物造成危害的问题，在生态渔业和药物控制上，开发潜力巨大[7]。在海水养殖方面，对于不同芽孢杆菌对弧菌抑制效果的研究较少，选用品种和使用方法尚不清晰，针对这种情况，本实验选取实际生产中常用的5种芽孢杆菌，在同一海水环境下，探究其对混合弧菌的抑菌效果，为海水养殖过程中使用芽孢杆菌控制弧菌提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 实验用菌

实验使用的巨弧菌（vibrio giantis）、嗜环弧菌（Vibrio cyclitrophicus）、弗尼斯弧菌（Vibrio furnissii）和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）分离自患病牙鲆;地衣芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、枯草芽孢杆菌（B.licheniformis）、多粘芽孢杆菌（B.coagulans）、凝结芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）和侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporu）来自河北农业大学海洋学院实验室，芽孢杆菌使用前，将菌粉、红糖、无菌水以1∶0.5∶20的比例充氣活化3 h，血球计数板计数。

1.2 实验方法

实验采用静水方法，不充气;在1 000 mL烧杯内加入盐度33‰的人工配制海水900 mL，同时加入100 mL的牛肉膏蛋白胨营养液。每组分别添加枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌，分别配制成1×104、1×105、1×106 cfu/mL的浓度梯度;添加巨弧菌、嗜环弧菌、弗尼斯弧菌和溶藻弧菌（1∶1∶1∶1）的混合弧菌，配制成5.5×103 cfu/mL浓度;对照组不添加芽孢杆菌。实验设置3个平行，在室温条件下进行（17～25℃）。

实验为期7 d，每隔24 h采样，涂TCBS平板30℃培养24～30 h后进行弧菌菌落计数。

1.3 数据处理

所有数据均以平均值表示，采用Excel进行统计分析和SPSS 17.0分析软件进行显著性差异分析。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌对弧菌的抑制作用

不同浓度的枯草芽孢杆菌对混合弧菌的抑制效果见图1。

实验结果表明，1×104 cfu/mL、1×105 cfu/mL和1×106 cfu/mL浓度组的枯草芽孢杆菌对弧菌均有明显抑制作用，弧菌浓度均显著低于对照组（P<0.05）;3个浓度组之间没有显著差异。

2.2 地衣芽孢杆菌对弧菌的抑制作用

不同浓度的地衣芽孢杆菌对混合弧菌的抑制效果见图2。

2.3 多粘类芽孢杆菌对弧菌的抑制作用

不同浓度的多粘类芽孢杆菌对混合弧菌的抑制效果见图3。

实验结果表明，1×104 cfu/mL、1×105 cfu/mL和1×106 cfu/mL浓度组的枯草芽孢杆菌对弧菌均有明显抑制作用，弧菌浓度均显著低于对照组（P<0.05）; 106 cfu/mL浓度组的弧菌浓度显著低于104 cfu/mL、105 cfu/mL组（P<0.05）。

2.4 凝结芽孢杆菌对弧菌的抑制作用

不同浓度的凝结芽孢杆菌对混合弧菌的抑制效果见图4。

2.5 侧孢短芽孢杆菌对弧菌的抑制作用

不同浓度的侧孢短芽孢杆菌对混合弧菌的抑制效果见图5。

2.6 五种芽孢杆菌的抑菌能力比较

不同浓度的5种芽孢杆菌对混合弧菌的抑制效果见图6。

由图6可知， 104 cfu/mL浓度组，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌组的弧菌浓度均显著低于多粘类芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌组（P<0.05）;105 cfu/mL浓度组，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌组的弧菌浓度显著低于多粘类芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌组（P<0.05）;106 cfu/mL浓度组，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢杆菌和多粘芽孢杆菌组的弧菌浓度均显著低于凝结芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌组（P<0.05）。

3 讨论

芽孢杆菌在生长的过程中会产生脂肽类化合物、聚酮类化合物等多种物质，这些抗菌活性物质通过胞膜攻击作用、诱导细胞凋亡、线粒体攻击作用、抑制蛋白质及细胞壁合成等作用方式抑制弧菌生长。向亚萍等[8]研究发现55株芽孢杆菌以及脂肽类抗生素对3个病原菌都具有不同程度的抑菌活性，并提出芽孢杆菌脂肽类抗生素具有多样性并且是抑制病原菌的主要因子。王芳等[9]通过大孔吸附树脂法对芽孢杆菌能产出抑菌成分进行提纯，得到一系列环肽类抗菌化合物。

本实验结果显示，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌表现出较强的抑制弧菌能力，这可能与其增殖能力较强以及分泌的抗菌活性物质更为有效有关。闫茂仓等[10]采用与本实验相似的方法发现枯草芽孢杆菌对泥蚶养殖底泥中的弧菌有抑制作用，5×103 cfu/mL和1×104 cfu/mL浓度组弧菌总数显著低于1×103 cfu/mL组（P<0.05）;黄汝添等[11]发现 4×106 cfu/mL枯草芽孢杆菌对溶藻弧菌的生长有明显的抑制效果。本实验结果与他们一致。目前，关于多粘类芽孢杆菌、凝结枯草芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌对弧菌抑制作用的报道较少，而本实验表明，这3株芽孢杆菌对弧菌也有较强的抑制作用，可以考虑在实际生产中使用。

参考文献：

[1] 王凤青，孙玉增，任利华，等.海水养殖中水产动物主要致病弧菌研究进展[J].中国渔业质量与标准，2018，8（02）：49-56.

[2] 黄小丽，邓永强.我国水产消毒剂的应用现状[J].内陆水产，2004（09）：26-27.

[3] 刘秀梅，邵守峰，薛丰松.自腹泻病人、海水、海产品中分离出麦氏弧菌及其毒素原性的研究[J].中国卫生检验杂志，1998（06）：3-5.

[4] 司秀芳.水产消毒剂在养殖生产中的应用及发展趋势[J].渔业致富指南，2009（07）：52-53.

[5] 苏艳莉，孙盛明，朱健，等.枯草芽孢杆菌在水产养殖中的研究进展[J].中国渔业质量与标准，2016，6（06）：32-39.

[6] 阎斌伦，王笃彩，李士虎，等.枯草芽孢杆菌的活性与环境因子的相关性研究[J].淡水渔业，2005（01）：13-15.

[7] 郝向举，李义，孙汉，等.蟹源益生芽孢杆菌的筛选[J].中国饲料，2009（22）：11-14.

[8] 向亚萍，陈志谊，罗楚平，等.芽孢杆菌的抑菌活性与其产脂肽类抗生素的相关性[J].中国农业科学，2015，48（20）：4064-4076.

[9] 王芳，纪明山，谷祖敏，等.枯草芽孢杆菌B36抑菌活性成分的初步提取[J].湖北农业科学，2009，48（04）：874-876.

[10] 闫茂仓，林志华，刘连生，等.枯草芽孢杆菌对泥蚶及养殖底泥中细菌总数和弧菌总数的影响[J].海洋科学，2009，33（10）：36-39.

[11] 黄汝添，谢海平，陆勇军，等.枯草芽孢杆菌Bs-1拮抗溶藻弧菌的特性[ J].热带海洋学报，2006，25（4）：51-55.

（收稿日期：2020-10-10）

基金项目：基金项目：河北省现代农业产业技术体系特色海产品创新团队（编号：HBCT2018170206，HBCT2018170203）。

作者简介：张建业（1994.5-），男，硕士研究生，研究方向：水产动物病害。E-mail：491885334@qq.com。

通信作者：宫春光（1971.4-），男，副教授，主要从事水产动物病害的教学与研究。E-mail：gongcg2005@163.com。