刺参-栉孔扇贝复合养殖系统多环芳烃的分布特征
孙永军 徐林波 鞠文明 唐晓波 高勤峰
摘?要：研究了刺参与栉孔扇贝复合养殖系统中，16种需要优先控制的多环芳烃（PAHs）类化合物在养殖刺参和栉孔扇贝与栉孔扇贝粪便及养殖环境中悬浮颗粒物和沉积物的分布特征。采用索氏提取和气相色谱质谱联用（GC/MS）的方法測定PAHs含量，并运用特定比值，包括荧蒽/（荧蒽+芘）、苯并[a]蒽/（苯并[a]蒽+屈）、芘/苯并[a]芘和低环与中高环PAHs组分的丰度比（LMW/HMW）等对其来源进行分析。经过检测和分析，取得以下研究结果：在16种需要优先控制的PAHs类化合物中，一共检测到15种不同的PAHs化合物，仅二苯并[a，h]蒽未被检测到。PAHs总含量最大的为悬浮颗粒物，其次依次为扇贝粪便、扇贝体组织、刺参体组织和表层沉积物。所有样品中的PAHs以中高环组分占据优势，且多以4～6环为主，低环与中高环组分的丰度比均小于1。混养模式下，刺参体组织中多环芳烃受两方面来源即表层沉积物及扇贝粪便的双重影响。通过多环芳烃绝对含量和相对比值的分析，结果表明，石油、煤和汽车尾气等化石燃料燃烧释放的污染源是样品中PAHs的主要来源。
关键词：刺参（Apostichopus japonicus）;栉孔扇贝（Azumapecten farreri）;多环芳烃;复合养殖系统
刺参（Apostichopus japonicus），又名仿刺参，属棘皮动物门（Echinodermata），海参纲（Holothuroidea），刺参科（Stichopodidae）[1]。刺参是我国传统的名贵海珍品之一，由于具有较高的营养价值与药用价值，成为我国重要的海水养殖经济种类，刺参养殖业已成为我国海水养殖产业的支柱品种之一。刺参的养殖模式多样，刺参养殖海区大多集中在近岸或潮间带海域，而临岸海域正是各种陆源性工业污染或者生活污染排放物以及养殖生产活动本身产生污染的汇集场所，从而导致养殖水域的环境污染，进而影响刺参的生长、存活及其生理状态，并最终影响养殖刺参的品质与安全[2-3]。另外，由于海上溢油事故和船舶运输等造成的海洋污染也不可小视，尤其是石油开采过程设备故障造成的漏油以及储运过程中管线破裂和船舶碰撞引起的漏油事故，都显著影响近海水域环境。
多环芳烃是最早发现的具有致癌效应的有机污染物，广泛存在于大气、水体及土壤环境中且多以吸附态形式出现，能通过食物链传递在高营养级生物体内产生生物放大作用并大量富集，从而严重威胁消费者健康。多环芳烃类化合物（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons ，PAHs）的结构特点为以稠环或非稠环形式将两个或两个以上的苯环连接在一起，是具有强致癌性和持久性的广泛分布的有机污染物，美国EPA将其列为优先控制的环境污染物。多环芳烃类化合物主要通过海上石油开采和运输过程的泄漏、陆源性的工业和日常生活废水排放以及地表径流、空气颗粒沉降或水气交换等途径进入水体，进而对水生生物造成不利影响[4-6]。目前有关PAHs的研究主要集中在河流和湖泊等内陆水域及近岸海域的水体、沉积物和生物体[7-11]。目前有关复合养殖模式中PAHs类化合物在生物与生物之间、生物与环境之间的传递过程的研究报道甚少。本研究对16种优控多环芳烃类化合物在刺参-栉孔扇贝复合养殖系统中沉积物和水体颗粒物以及养殖生物中的含量和种类组成进行测定，并采用比值法对复合养殖系统内PAHs类污染物来源进行了分析，旨在为海水养殖产品减少多环芳烃类化合物污染，保障海洋水产品的安全与质量，提高海水健康养殖技术提供理论依据和数据支持。
1?材料与方法
1.1?仪器与试剂
本实验使用的主要测试仪器GC-MS质谱联用仪为安捷伦Agilent 6890-5975MS，其它仪器包括索氏抽提器和旋转蒸发皿（上海亚荣生化仪器有限公司，型号RE-2000A）。使用试剂包括色谱级二氯甲烷、正己烷及丙酮均购自天津科密欧化学试剂有限公司。16种PAHs回收率指示物和测定标准品购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。用二氯甲烷对无水硫酸钠抽提24 h以上，风干后在450 ℃温度条件下灼烧4 h后，干燥器中保存备用。采用二氯甲烷抽提硅胶和中性氧化铝72 h后，将硅胶在120 ℃温度条件下活化12 h，以3%的高纯水去活化平衡，浸于正己烷溶液备用。使用重铬酸钾将实验所用玻璃仪器浸泡24 h，并清洗、烘干后在450 ℃温度条件下灼烧6小时以上去除所有有机物再使用。
1.2?养殖实验
本实验在山东省荣成市好当家集团刺参养殖池塘内进行，通过在栉孔扇贝养殖吊笼中搭配混养刺参建立刺参与栉孔扇贝复合养殖系统作为处理组，刺参和栉孔扇贝单养作为对照组，因此实验一共设置3组，每组设置3个重复。采用塑料浮漂将扇贝养殖吊笼悬浮于水面以下1.0 m处，在养殖笼底部加挂水泥管作为配重将其固定，防止其随水流漂移。使用扇贝吊笼构建刺参与栉孔扇贝混养系统，将6层扇贝养殖吊笼分为上下两部分，上部3层养殖栉孔扇贝，底部3层养殖刺参。用网目0.5 cm的网围围住养殖吊笼的底部和放养刺参的隔层侧面，以防止刺参从笼中逃逸。
1.3?样品采集
经过1个月养殖后采集刺参和栉孔扇贝样品，栉孔扇贝样品采集后去壳，用超纯水将栉孔扇贝软组织部分和刺参冲洗干净后，即时置于-20 ℃下冰箱冷冻保存待测。表层沉积物用自制圆筒状采泥器采集，用采水器采集水面以下1 m深处的水样，然后用0.45μm的Whatman GF/F玻璃纤维真空抽滤适量水样，以取得悬浮颗粒物样品，将其置于密封培养皿，并冷冻保存。用实验池塘海水单独养殖一批栉孔扇贝，并收集其粪便，冷冻保存用于后续测定。
1.4?样品预处理
生物样品测定用量为5 g，表层沉积物样品测定用量为8 g，将准确称量的样品包于已预抽提干净的滤纸中，然后加入回收率指示物标准品，再用体积比1∶1∶1的二氯甲烷∶丙酮∶正己烷混合有机溶液（120 mL）进行索氏抽提24 h，将适量活性铜片加入抽提溶液中，以去除样品中的硫成分。使用旋转蒸发仪将以上步骤得到的抽提液浓缩至10 mL，以无水硫酸钠去水之后转移至鸡心瓶中（容量l00 mL）。再次旋转蒸发，进一步浓缩液至l mL左右，加入10 mL正己烷进行溶剂置换后重新浓缩至1 mL。用1∶2氧化铝/硅胶净化柱（氧化铝和硅胶分别为6 cm和12 cm）净化经过两次浓缩得到的浓缩液，先后用正已烷（15 mL）和正己烷∶二氯甲烷=7∶3混合液（70 mL）洗脱，将第二组洗脱液浓缩至l mL左右，以缓慢的高纯氮气流将样品吹至近干，然后以色谱纯正己烷精确定容至500 μL，最后转移至棕色避光样品瓶中保存待测。
1.5?样品分析与质量保证
1.5.1?样品分析?采用Agilent 5973N型质谱仪（GC-MS）和6890N型气相色谱仪进行16种多环芳烃类化合物含量测定。测试过程中，质谱仪采用选择离子扫描方式（SIM），扫描质量范围（m/z）为50～550 amu，倍增电压2 506。使用EI离子源，温度230 ℃，四极杆温度150 ℃。气相色谱仪所用色谱柱型号为HP-5MS，规格30 m×0.25 mm×0.25μm。气相色谱测定进样方式为不分流进样，进样量2 μL，载气氦气，流速1 mL·min-1。气化室进样口温度260 ℃，升温程序以60 ℃为起始初温，保持1 min后，以6 ℃·min-1的速度升温至200 ℃，再以8 ℃·min-1的速度升温至300 ℃，保持5 min。
1.5.2?质量保证?本实验由于样品来源较多，且PAHs样品分析预处理过程非常繁琐复杂，分析费用也较为昂贵，因此每样品仅分析单个样品，并未设立样品平行样，代之以EPA基质加标的质量控制方法，实现数据质量保证。本实验采用外标法定量测定16种PAHs化合物，包括萘、苊烯、苊、蒽、芴、菲、苯并[a]蒽、荧蒽、屈、芘、苯并[a]芘、茚并[1，2，3-cd]芘、二苯并[a，h]蒽和苯并[g，h，I]苝。分析方法的基质加标回收率为75%～110%，检测限0.1～3.2 ng/g之间。因苯并[k]荧蒽苯和并[b]荧蒽的波峰出峰时间高度重叠，因此难以区分，将这两个组分合并为一个，命名为苯并[b+k]荧蒽（B（b+k）F）[12-13]。
2?结果与分析
2.1?PAHs在生物和环境中的含量分布
生物样品和环境样品中不同PAHs化合物含量分布见表1。PAHs化合物在单养组和混养组刺参体组织出现的种类相同，但是不同多环芳烃种类在刺参体内的含量不同，且同一多环芳烃单体在单养和混养刺参之间存在差异。二苯并[a，h]蒽在所有样品中均未检出。栉孔扇贝体内总多环芳烃含量高于刺参体组织含量，也高于表层沉积物中的含量，且萘、苊、苊烯、菲、芴和芘的含量均显著高于刺参和沉积物中含量，荧蒽、苯并[b+K]荧蒽、苯并[a]芘、屈的含量则低于刺参，苯并[g，h，I]苝在栉孔扇贝体内未被检出。表层沉积物中多环芳烃总量和各单体含量均低于栉孔扇贝和刺参体组织含量。栉孔扇贝粪便中的萘、芴、苊烯、芘、菲、苯并[b+K]荧蒽、苯并[g，h，I]苝、苯并[a]芘、茚并[1，2，3-cd]芘的含量均高于表层沉积物和刺参体组织，而荧蒽、苊和屈的含量则低于刺参体组织。PAHs化合物在悬浮颗粒物中总体上表现出较高含量，且显著高于栉孔扇贝、栉孔扇贝粪便、刺参和表层沉积物中的含量，主要原因是PAHs类污染物极易附着在悬浮颗粒物上，且不易溶于水，因此，悬浮颗粒物中PAHs的總含量显著高于实验采集的其它样品。
2.2?不同样品的PAHs组成特征
刺参、栉孔扇贝、悬浮颗粒物和表层沉积物中PAHs的环数分布如图1所示。相同环数PAHs的分布比例在不同样品间表现出不同分布，且不同环数的PAHs在同一样品中的比例亦不相同。4～6环高分子量PAHs占总量比例为51.84%～78.22%，其中，4环PAHs在16种PAHs中表现为优势组，尤其在悬浮颗粒物中比例最高，达77%。所测样品中，6环PAHs在所有PAHs中所占比例最低。南海中部表层沉积物中PAHs的研究结果表明，16种多环芳烃以4～6环芳香物为主，占多环芳烃含量68.15%～86.51%，与本研究结果基本一致[14]。
2.3?多环芳烃的来源鉴定
目前有关环境中PAHs污染物的来源鉴定方法较多，例如轮廓土法、同位素法和比值法等[15]。相对于其它方法，比值法更直观且易操作，因此得到较为广泛的应用[16-18]。前期研究表明高于或等于4环的高分子量（HMW）PAHs主要由燃烧产生，而2～3环的低分子量（LMW）PAHs则主要来源于石油类物质[13，19]。因此，汽油、柴油等化石燃料燃烧产生的汽车尾气中的PAHs多以4～6环高环PAHs占据优势，相应的LMW/HMW比值小于1;而石油泄漏等产生的原油污染PAHs则多以2～3环低环PAHs占据优势，其LMW/HMW比值大于1[19]。如图2所示，本实验中所测各样品的LMW/HMW比值均小于1，表明样品多以4～6环PAHs为主，且化石燃料燃烧是样品中多环芳烃的主要来源。该研究结果与前期在南黄海表层沉积物中PAHs的研究结果一致[14]。沉积物中多环大分子量PAHs相对稳定，相反低环低分子量PAHs易挥发和降解，因此沉积物中4～6环多环PAHs比例相对较高[20]。
大量研究结果表明[6][21-24]，由于同分异构体进入环境后具有相同的稀释和分配行为，而PAHs母体所包含的同分异构体具有相同的理化性质，因此，一些特定的PAHs异构体之间的丰度比值可作为一种化学指标来示踪其来源。根据Yunker et al的报导[25]，小于0.4的荧蒽/（荧蒽+芘）比值[Fla /（Fla+Pyr）]表示PAHs来源于石油污染，大于0.5的比值表示PAHs来源于煤或者木柴燃烧，处于0.4与0.5之间的比值则表示PAHs来源于石油或者其精炼产品的燃烧。小于0.2的苯并[a]蒽/（苯并[a]蒽+屈）比值[BaA/（ BaA+Chry）]表明PAHs污染来源主要是石油污染，大于0.35的比值则表示PAHs是来源于燃烧，位于0.2与0.35之间的比值则可能是受燃烧污染与石油污染的双重影响。芘/苯并[a]芘比值（Pyr/Bap）可作为区分燃油和燃煤来源PAHs的重要参数，一般认为小于1的比值表示燃煤来源，1～ 6之间的比值范围表示燃油（尾气）来源的PAHs污染[26-27]。
不同样品的比值特征见表2。单养组和混养组的刺参、栉孔扇贝体组织以及表层沉积物的比值均小于0.4，因此可推断以上样品所含PAHs以来自石油污染为主;而悬浮颗粒物的荧蒽/（荧蒽+芘）比值则为0.5，可以推断其PAHs来源以石油及其精炼产品的燃烧为主。单养和混养组刺参以及栉孔扇贝、表层沉积物和悬浮颗粒物等所有样品的苯并[a]蒽/（苯并[a]蒽+屈）比值均大于0.35，因此可以推断其PAHs污染来源以燃烧源为主。另外根据所测样品中大于1的芘/苯并[a]芘比值，可以推断PAHs污染主要来源于燃油燃烧产生的尾气排放。综合以上结果，可以推断刺参和栉孔扇贝体组织以及环境样品中表层沉积物和悬浮颗粒物PAHs污染以来自石油燃烧源为主，结合当地的产业分布考虑，这一结果可能与研究海区附近港口和码头建设、工业厂房建设以及近年机动车数量的快速增加具有密切关系。
3?讨论
3.1?样品中多环芳烃组成及差异性分析
PAHs在生物和环境样品中的含量分布表明，本研究所测样品除二苯并[a，h]蒽未被检出外，其他15种EPA优控PAHs类化合物都被检测到。由表1中PAHs总含量数据可知，所测样品中以悬浮颗粒物的PAHs总含量最高，之后为栉孔扇贝粪便>栉孔扇贝>刺参>表层沉积物。悬浮颗粒物中PAHs总含量为最高，分析其主要原因为PAHs类化合物的物理性质特点为易于吸附在包括悬浮颗粒物在内的微小固体颗粒，且不易溶于水。本研究养殖所在地点山东省好当家集团刺参养殖池塘所处区域工农业生产和人类活动较为密集，因而周边汽车交通和运输导致环境中粉尘增加，空气粉尘可通过大气沉降或者水气作用进入水体，引起水体悬浮颗粒中PAHs含量升高，进一步加剧PAHs污染。单养模式与扇贝混养模式下，尽管刺参体组织内PAHs总量没有表现出显著差异，但是刺参体组织PAHs不同组分在两种不同的养殖模式间表现不同。混养模式的刺参体组织2～3环PAHS含量显著低于单养模式，而4～6环PAHs含量则高于单养模式。原因主要是刺参单养时，其食物来源包括水体悬浮颗粒物;混养模式下，栉孔扇贝通过滤食水体悬浮颗粒物，从而降低了水体悬浮颗粒物的沉降作用，代之以表层沉积物和栉孔扇贝粪便成为刺参主要食物来源，而4～6环PAHs在栉孔扇贝粪便中含量也相对较高。
3.2?多环芳烃来源分析
本研究通过对生物样和环境中多环芳烃LMW/HMW比值以及异构体比值对其来源进行解析。结果显示所测样品中LMW/HMW比值均小于1，表明多环芳烃是以4～6环的高环组分为主，可以推断其主要来源为化石燃料燃烧而产生。该结果与此前报导海河和渤海湾表层沉积物的PAHs污染物来源分析[15]以及南黄海表层沉积物PAHs来源的分析[14]基本一致。其共同原因可能为近年来随着我国工业化和城市化进程的不断加快，汽车交通和运输量的急剧增多，导致了柴油、汽油和煤等化石燃料消耗量的快速增加。此前类似研究结果表明，汽车尾气排放、炼焦和燃煤为天津地区土壤中PAHs类化合物污染的主要来源[28]。芘/苯并[a]芘、苯并[a]蒽/（苯并[a]蒽+屈）及荧蒽/（荧蒽+芘）等异构体比值分析结果表明，源自石油燃烧的PAHs为样品中PAHs类化合物污染的主要来源，这一结果可能与该研究海区附近近年来较为强烈的工业生产活动、人类生活活动而导致的机动车数量大规模增加以及快速增加的港口和码头建设及海上运输有着密切联系。需要優控的16种PAHs可分为2至6环化合物，4～6环高分子量PAHs在本研究所测定的样品中占有较为显著的优势，这一方面可能与高分子量PAHs比低分子量PAHs的性质更为稳定相关，另一方面，燃烧源产生的PAHs多为高分子量PAHs，这与采用异构体比值分析和LMW/HMW比值进行来源分析得到的结果相一致。
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（收稿日期：2020-05-21）
