牛腹泻病毒检测（PCR法）及其影响因素分析

    林春丽+张海波+陈红霞+侯春燕+云雨生

    

    

    

    摘要：PCR技术是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，该技术通过重复高温变性、低温退火、中温延伸等简单的3个温度循环，能将靶DNA扩增数百万倍，获得极高的检测敏感性。通过PCR技术对新生牛是否带有牛病毒性腹泻病毒的血清样本进行检验，并对影响其检测效果的因素进行了分析。

    关键词：牛腹泻病毒（BVDV）；PCR；引物

    中图分类号：S858.23 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2017）04-0005-02

    牛病毒性腹泻（黏膜病）是由牛病毒性腹泻病毒[1]（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起的传染病，各种年龄的牛均易感染、以幼龄牛易感性最高。

    牛病毒性腹泻（黏膜病）的病原体属于披膜病毒科瘟病毒属的成员。病毒粒子呈圆形，有囊膜，直径50～80 nm。RNA核芯直径（24±4）nm，分子量3×106，沉降系数80～90 s。

    牛病毒性腹泻（黏膜病）可以穿过胎盘感染，特别是怀孕早期。其病毒血清抗体阴性的母牛一旦感染，常常通过胎盘使胎儿产生免疫抑制，引起持续性病毒血症，如果小牛正常产出，病毒血症能持续地带入成年期，这种牛临床貌似健康，血清中又无保护性抗体，但体内始终带毒，是牛群中最危险的传染源[2]。

    本研究是通过PCR技术检验新生牛是否带有牛病毒性腹泻病毒，排除患病牛，制备无病毒血清，进一步用于兽药的研制，并对影响其检测效果的因素进行了分析。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 主要试剂 RNAiso plus，购自Takara公司；氯仿、无水乙醇、75%乙醇，DEPC水、ddH2O、DNA Marker購自TakaRa公司；核酸染料购自百泰克有限公司。

    1.1.2 器材、仪器准备 1 000 μL枪，200 μL枪，50 μL枪，1 000 μL枪头，200 μL枪头，75%酒精棉，止血钳，EP管，EP管架；PCR扩增仪（美国伯乐公司，型号为S1000）等。

    1.1.3 样品 共24个样本，包括22个未知样本（均为新生牛初血清），阴性对照和阳性对照。

    1.2 方法

    PCR技术，即聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）是由Saiki发明，因其技术对世界生物医学的巨大推动作用，获得了1992年的诺贝尔医学奖[3]。由美国PE-Cetus公司的Kary Banks Mulis在1985年建立的[4]。这项技术可在试管内经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。

    1.2.1 提取步骤

    （1）取2 mL无菌无酶EP管，加入RNA Siso Plus（裂解液）900 μL（加液过程中如枪头接触到EP管壁或其他物品，需更换枪头），再分别吸取待测血清样品、阳性对照、阴性对照各200 μL于EP管中，每加一次样品换一次枪头。轻轻上下颠倒摇匀至底部无沉淀，颜色均一，冰盒中静置5 min。将已检测样品放-20 ℃冷冻保存（阴性对照放在中间顺序）。

    （2）12 000 r/min、4 ℃离心1 min。加入200 μL的氯仿，上下颠倒20次混匀，至颜色均一为乳粉色，冰盒中静置8 min。

    （3）12 000 r/min、4 ℃离心15 min。在离心剩余2 min时准备新1.5 mL无菌无酶EP管，加入800 mL -20 ℃预冷的异丙醇。从离心机轻拿轻放取出EP管（离心后液体分为三层，底层为有机溶液层，中层蛋白质，上层上清液含RNA）。吸取400 μL上清液（分两次，每次200 μL吸取，吸取上层液体时切勿碰触或吸取中层蛋白质），放入事先加好异丙醇的新1.5 mLEP管中，轻轻上下颠倒20次摇匀，-20 ℃静置20 min[5]。

    （4）12 000 r/min、4 ℃离心15 min。离心机中EP管摆放方向保持一致，以使沉淀在管底同一侧。若离心后不出沉淀继续-20 ℃放置10～20 min后离心。弃上清，保留沉淀。沉淀即为RNA提取物，量很少，在倒上清液时注意切勿将沉淀倒出。

    （5）加入1 mL75%乙醇（DEPC水配制，加乙醇过程中如枪头接触到EP管壁或其他物品，需更换枪头），轻轻上下颠倒，洗涤沉淀，将沉淀悬浮起来即可。

    （6）7 500 r/min、4 ℃离心5 min。弃上清，保留沉淀。用200 μL枪头将管底残余乙醇液体吸净，吸取一个样品换一个枪头，注意不要碰触和吸取到RNA沉淀。

    （7）EP管中的RNA在超净工作台中室温下自然干燥10 min。加入20 μL的无RNase水（将水加到沉淀上），轻弹溶解沉淀，短期使用-20 ℃保存，长期使用保存于-70 ℃下。

    1.2.2 引物设计 根据GeneBank数据库，使用引物设计软件Primeier 5.0设计BVDV特异性引物（表1、表2）。

    PCR反应：反应体系：25 μL，配制在冰盒上进行，设定好反应程序后，将装有上述体系液体PCR反应管包括对照管（空白PCR体系管和水样PCR体系管）放入Smart CycLer System中按照表3参数设定PCR仪进行 PCR反应。

    1.2.3 电泳分析

    （1）制胶。称取1.35 g琼脂糖粉放入锥形瓶中（注：倒入过程中避免琼脂糖粉末粘在锥形瓶壁上）。加入90 mL 1×TBE溶液，微波炉加热无絮状物至完全溶解（注：至少沸腾3次），取出锥形瓶后，冷却至60 ℃左右，加入17μL的核酸染料，摇至彻底混匀后倒入带有梳子的胶槽中（轻轻混匀即可，避免气泡产生），冷却凝固40 min。

    （2）将制好的胶放入电泳槽中，倒入1×TBE，液位高于胶面2 mm。

    （3）用移液枪取样品与6×Loading Buffer混合点于胶孔中。

    （4）将电泳仪正负极对应连接，开启电泳仪电源开关，在120 V电压下电泳50 min。将跑完的琼脂糖凝胶从电泳槽取出，放在凝胶成像仪中，进行观察。

    2 结果与分析

    2.1 结果

    由图2可见，12号为阴性对照，无明亮的条带；24号为阳性对照，出现明亮的条带，证明试验成立。剩余样本在316 bp处，8、9、10、11、20、21、23号出现明亮的条带，说明该样本血清样本染牛腹泻病毒。

    2.2 影响PCR检测的因素

    2.2.1 dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，如保存不当易变性失去生物学活性。在PCR反应中，dNTP应为50～200 μmol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等，如其中任何一种浓度不同于其他几种时（偏高或偏低），就会引起错配[6]。

    2.2.2 Mg2+濃度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著影响。在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200 μmol/L 时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

    2.2.3 温度与时间的设置 基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点[7]。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95 ℃变性，再迅速冷却至40～60 ℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75 ℃，在Taq DNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。

    2.2.4 循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。一般认为PCR产物应在48 h以内完成电泳检测，有些最好于当日电泳检测，大于48 h后带型就会出现不规则，甚至消失。所以精细的分子实验，操作过程的每一步都必须谨慎细致，才可保证准确的实验结果。

    参考文献：

    [1] 王建领，付彤，刘 杰，等.牛病毒性腹泻分子及血清流行病学研究进展[J].河南农业科学，2012（3）：7-11.

    [2] 张会敏，郑明学，古少鹏，等.牛病毒性腹泻的流行情况及防制[J].中国畜牧兽医，2009（11）：120-122.

    [3] 覃德文，云朝光，秦武明，等.PCR技术发展状况研究[J].林业实用技术，2013（6）：6-8.

    [4] 张许文琦.PCR技术的研究及应用[J].长江工程职业技术学院学报，2013（3）：4-7，12.

    [5] 徐平丽，赵晋平，孟静静，等.一种适宜拟南芥PCR检测的DNA提取方法[J].安徽农业科学，2010，38（13）：6653-6654.

    [6] 彭仕明，黄 勉，陈 武，等.棕熊蛔虫ITS rDNA的PCR扩增与序列分析[J].中国兽医寄生虫病，2008（3）：1-5.

    [7] 金宇良.PCR技术的研究进展[J].现代农业科技，2012（10）：47-48.