三种离子通道在中国鲎脑神经节的分布

    

    

    摘 要：应用组织切片和免疫组织化学的方法在中国鲎脑神经中定位了3种离子通道的分布。研究检测到Na+通道和K+通道免疫阳性细胞和阳性纤维，但没有检测到Ca2+通道的免疫阳性。Na+通道主要分布在中间体神经纤维网和背面中央細胞群，K+通道分布于背面侧后方第二细胞群和背面中央细胞群。

    关键词：中国鲎（Tachypleus tridentatus）;离子通道;免疫组化

    中国鲎（Tachypleus tridentatus）隶属于节肢动物门（Arthropoda）、螯亚门（Chelicerta）、肢口纲（Merostomata）、剑尾目（Xiphosura），其存在于世已有数亿年的历史，被称为“活化石”，是一种具有极其重要科研价值的生物，一直是国内外学者感兴趣的研究对象[1]。国内学者对中国鲎的研究主要集中在保护区建设、人工育苗[2]、复眼形态[3]、抗菌肽研究[4]和性腺、胚胎发育[5-7]方面，有关中国鲎神经器官的研究却鲜有报道，笔者曾利用组织切片，HE染色研究了中国鲎脑神经节的形态结构[8]，利用免疫组化分析了5羟色胺（5-HT）和促性腺激素释放激素（GnRH）在中国鲎脑神经节的分布[9-10]。本实验利用免疫组织化学方法，对中国鲎脑神经节内Na+、K+、Ca2+通道进行了定位，旨在为中国鲎神经内分泌的研究提供资料。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物

    成体中国鲎购买于厦门市第八水产品市场，雄鲎壳宽为21～25 cm，雌鲎壳宽为25～31 cm。快速去除中国鲎背部外壳，其消化道位于鲎身体中轴线位置。沿着消化道向食道方向剥离其他组织，可见围咽神经环位于食道靠近口的部位。脑神经节即为围咽神经环的前部。

    1.2 实验试剂

    Ca2+通道抗体（ab93606）和Na+通道抗体（ab56240）购于Abcam公司，K+通道抗体（p4872）购与Sigma公司。DAB显色试剂盒和羊抗兔SABC免疫细胞化学试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。

    1.3 实验步骤

    迅速解剖出脑神经节，于波恩氏液4 ℃固定过夜。组织块经梯度酒精脱水、二甲苯透明、透蜡，包埋后连续切片，切片厚度为7 μm。

    切片脱蜡至水;3% H2O2-PBS溶液室温孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性;滴加正常山羊血清（1∶10）室温孵育10 min;滴加5-HT兔抗体（1∶8 000），阴性对照实验采用正常羊血清代替一抗，4 ℃孵育过夜;PBS 浸洗三次;滴加生物素标记羊抗兔IgG;室温反应30 min;PBS浸洗三次;滴加即用型链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，室温反应20 min;PBS浸洗三次;0.06% DAB显色5～10 min;苏木精复染，脱水，透明，封片，Olympus BX51型显微镜下观察、拍照。

    2 结果

    研究发现中国鲎脑中分布着Na+和K+通道免疫阳性细胞和神经纤维，Ca2+通道在脑神经节所有的区域呈免疫阴性。所有结果如表1所示。

    Na+通道存在于中国鲎脑神经节中的视神经片层和视神经髓的少数神经纤维中，视神经片层和视神经髓的细胞体中没有发现Na+通道的阳性反应。在中间体中Na+通道分布在神经纤维网的外侧的少数神经纤维，中间体细胞群没有Na+通道的阳性反应。在背面中央细胞群的腹面靠近蕈形体前叶处存在着Na+通道的阳性细胞，这些细胞直径为15～30 μm。另外在蕈形体和蕈形体周围的细胞没有发现Na+通道的阳性反应。在中央神经纤维网中有部分靠近围咽神经环后方的神经纤维表现出Na+通道免疫阳性（如图1）。

    K+通道存在于中国鲎脑神经节中的视神经片层和视神经髓的少数神经纤维中，视神经片层和视神经髓的细胞体中没有发现K+通道的阳性反应。在中间体中K+通道分布在神经纤维网的外侧和两臂的神经纤维，其阳性较强。中间体细胞群和背面中央细胞群没有K+通道的阳性反应。在背面侧后方第二细胞群存在着K+通道的阳性细胞，这些细胞直径为15～30 μm。另外在蕈形体没有发现K+通道的阳性反应。在中央神经纤维网中有部分靠近围咽神经环后方的神经纤维表现出K+通道免疫阳性（如图1）。

    3 讨论

    离子通道是一类跨膜糖蛋白，它们在细胞膜上形成的亲水性孔道使带电荷的离子得以进行跨膜转运，是神经、肌肉、腺体等许多组织细胞膜上的基本兴奋单元，它们能产生和传导电信号，具有重要的生理功能[11]。

    有关鲎的离子通道的研究主要是以美洲鲎的腹部光感受器为研究对象，研究发现该光感受器内的Ca2+通道是光线依赖的[12]。对于鲎的神经系统中的离子通道的分布和特性尚未见报道。

    在脊椎动物中Na+通道广泛存在于可兴奋的细胞中，它的开放主要是使细胞去极化，并传播动作电位。在维持细胞兴奋性和正常的生理功能中起重要的作用[13]。在背面中央细胞群的某些细胞发现Na+通道的存在，这说明Na+通道可能与这些神经细胞的兴奋有关。在中央神经纤维网的神经纤维上也发现了Na+通道，这些Na+通道定位在轴突上，或许该区域的Na+通道与背面中央细胞群的功能不同。

    K+通道是细胞动作电位复极的主要离子电流。它们的变化对动作电位的形状和时程均有较大影响[14]。该通道是许多药物的主要靶位点。研究表明K+通道在视神经片层和视神经髓中有少数阳性纤维，说明其与视觉信号的传递有关。在中间体区域又发现了大量的阳性纤维，普遍认为鲎的中间体主要功能是视觉信息的处理和附肢的协调运作[15-16]。暗示这些功能与K+通道有关。

    我们没有在中国鲎脑神经节中发现Ca2+通道的阳性细胞或纤维，但是Ca2+通道是广泛存在于动物的神经系统内的[17]。可能是由于鲎脑神经节中的Ca2+通道的亚型不同。由于关于鲎脑神经节离子通道的报道很少，我们只能描述其的分布情况，对离子通道功能的确定还需进一步研究。

    參考文献：

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    [2] 李琼珍.中国鲎保育工作研究进展[J].生物学杂志，2010（04）：71-74.

    [3] 霍淑芳，刘润中，许华曦，等.中国鲎复眼的形态及超微结构研究[J].中国水产科学，2006（04）：517-523.

    [4] 谢海伟，王娣，杨贤松，等.鲎素抗菌肽作用机理研究[J].生物物理学报，2013（01）：26-34.

    [5] 梁军荣，王军，苏永全，等.中国鲎胚胎发育过程主要生化成分分析[J].中国水产科学，2000（02）：113-115.

    [6] 梁君荣，王军，苏永全，等.四种重金属对中国鲎（Tachypleus tridentatus）胚胎发育的影响[J].生态学报，2001（06）：1009-1012.

    [7] 王军，王德祥，苏永全，等.中国鲎的胚胎发育[J].动物学杂志，2001（04）：9-14.

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    [9] 李林明，黄辉洋，叶海辉，等.中国鲎脑神经节5-羟色胺免疫组化的定位观察[J].厦门大学学报（自然科学版），2015（01）：64-68.

    [10] Huang Huiyang，Li Linming，Ye Haihui，et al.Identification and distribution of gonadotropin-releasing hormone-like peptides in the brain of horseshoe crab Tachypleus tridentatus[J].Chinese Journal of Oceanology and Limnology，2013，31：384-390.

    [11] 司舒杰，刘天龙，刘小雷.电压门控钙离子通道的研究进展[J].北方药学，2012（01）：33-35.

    [12] Bacigalupo Juan，Lisman John E.Single-channel currents activated by light in Limulus ventral photoreceptors[J].1983.

    [13] 李宝珠，高炳淼，吴勇，等.钠离子通道研究进展[J].生物技术，2012（03）：94-97

    [14] 傅涛，郝选明.钾离子通道的研究进展[J].内蒙古石油化工，2010（10）：1-3.

    [15] Harzsch Steffen.Phylogenetic comparison of serotonin‐immunoreactive neurons in representatives of the Chilopoda，Diplopoda，and Chelicerata：Implications for arthropod relationships[J].Journal of morphology，2004，259 （2）：198-213.

    [16] Walker R J t，Roberts C Jane.The pharmacology of Limulus central neurons[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part C：Comparative Pharmacology，1982，72 （2）：391-401.

    [17] Hille Bertil.Ion channels of excitable membranes[M].Sinauer Sunderland，MA.2001，283.

    Abstract：The presence and distribution of 3 kinds of ion channels in the brain of Tachypleus tridentatus was investigated by immunocytochemistry.The immunoreactivity-cell （ir-cell） and ir-fiber of Na+ channels and K+ channels were found in the brain of T.tridentatus.Howerer，there was no ir-Ca2+ channels in T.tridentatus brain.Na+ channels located in CBN and DMG.K+ channels located in DMG and DLPG#2.

    Key words：Tachypleus tridentatus;ion channels;immunohistochemistry