重阳木锦斑蛾寄生真菌的分离与鉴定
洪权春 赵雷 王爽 童玲
摘要? ? 本文将被真菌寄生的重阳木锦斑蛾僵虫收集并带回实验室，进行了分离、纯化与鉴定，并开展人工饲养条件下回接试验。结果表明，喷雾和干孢子粉接种处理下真菌寄生率分别为49.4%和68.1%。通过形态学特征和ITS序列的测序分析确定分离到的菌株为黄曲霉。
关键词? ? 重阳木锦斑蛾;黄曲霉;分离;鉴定
中图分类号? ? R446.5? ? ? ? 文献标识码? ? A
文章编号? ?1007-5739（2020）21-0122-03? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 开放科学（资源服务）标识码（OSID）
Isolation? and? Identification? of? Fungus? Parasitizing? on? Histia? rhodope
HONG Quanchun 1，2? ? ZHAO Lei 2? ? WANG Shuang 1? ? TONG Ling 2
（1 College of Biology and Food， Shangqiu Normal University， Shangqiu Henan 476000; 2 Luohe City South-central of Henan Enemies Breeding and Research Center of Forestry Pest， Luohe Henan 462000）
Abstract? ? In this paper， the cadavers of Histia rhodope parasitized by the fungus were collected and brought back to the laboratory for isolation， purification and identification， and the inoculation tests were carried out under artificial rearing conditions. The results showed that the parasitic rate of strain was 49.4% and 68.1% respectively under spray and dry sporangia powder inoculation treatments. The strain was identified as Aspergillus flavus by morphological feature and ITS sequencing analysis.
Keywords? ? Histia rhodope; Aspergillus flavus; isolation; identification
重陽木（Bischofia polycarpa）是中国著名的园林行道观赏树种。城市绿地系统将重阳木规划为园林绿化重要树种之一。随着漯河市打造“国家园林城市”“国家森林城市”，丰富了园林树木种类和数量;同时，园林植物的病虫害结构也发生变化，给园林植被管理带来了新的挑战。重阳木锦斑蛾（Histia rhodope）属于鳞翅目（Lepidoptera）斑蛾科（Zygaenidae），为重阳木的主要食叶害虫，危害轻时可造成叶片缺刻，严重时可吃光整株树上的叶片，严重影响城市绿化效果[1]。目前对重阳木锦斑蛾的研究以害虫的发生规律[2-4]、生物学特性[5-7]等方面为主。防治以传统的化学农药防治为主[8-9]，有关生物防治报道仅限于生物农药防治，如使用印楝素、BT、阿维菌素等生物农药防治[10-11]。已报道的重阳木锦斑蛾天敌甚少，仅有绒茧蜂[12]、日本追寄蝇[13]、微孢子虫[14]等。
在漯河市区重阳木锦斑蛾调查中，笔者从采集的幼虫中得到被寄生僵虫，进行分离得到1株寄生真菌。为了进一步确认该菌株为重阳木锦斑蛾寄生菌，在试验条件下饲养重阳木锦斑蛾幼虫进行接菌试验，结合形态学观察和ITS序列测序分析，确定其分类地位。
1? ? 材料与方法
1.1? ? 试验材料
被真菌寄生样品为采集自漯河市人民路重阳木行道树树皮缝隙、树洞中被真菌感染的老熟幼虫或蛹，带回实验室供分离寄生真菌。
1.2? ? 试验方法
1.2.1? ? 虫口密度调查。2016年于漯河市郾城区进行了重阳木锦斑蛾虫口密度调查，在行道树两旁随机选取5株重阳木，每株剪取东、南、西、北方向距离树干1.5～2.5 m之间的树枝各1枝，记录枝条叶片数及对应虫量，并统计百叶虫量。
1.2.2? ? 寄生真菌的分离纯化。将采集到的重阳木锦斑蛾僵虫用70%乙醇浸泡3～5 s，再移至0.1%升汞水溶液中浸泡2～3 min，取出僵虫用无菌水换洗5次后，将其移至铺有双层灭菌滤纸的培养皿中，盖上培养皿盖，并置于25 ℃下保湿培养;待虫体长出菌丝后，用接种针挑取少量外缘菌丝划线接种于PDA平板上;随后将其用接种环挑取少量外边缘新鲜菌丝划线接种于PDA培养基中进行菌的纯化，4～5 d形成菌落;然后再观察证实为同一种真菌，再接到新的PDA培养基上，纯化3～4 次;挑取菌丝划线于试管培养基，培养3～4 d后放置于5 ℃冰箱进行菌种的保存备用。
1.2.3? ? 寄生菌的形态观察。将室外采集的寄生菌，在解剖显微镜下进行观察拍照。然后，用解剖针刮取少量放置载玻片上，在电子显微镜下观察分生孢子和分生孢子梗，并拍照。分离纯化后，对分离纯化得到的寄生真菌镜检，观察分生孢子梗及分生孢子的形态，对比前后拍得的形态图片判断是否为一种菌，然后进行拍照记录。
1.2.4? ? 分子生物学鉴定。采用改良的CTAB法提取真菌基因组DNA[15]，利用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGT
GAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGAT
ATGC-3′），以10×PCR Buffer 5 μL、模板DNA 3 μL、Taq酶0.5 μL、10 pmol引物各1 μL，补足ddH2O 39.5 μL构成50 μL反应体系;PCR反应程序为94 ℃预变性3 min、94 ℃变性30 s、50 ℃退火45 s、72 ℃延伸1 min，35个循环，最后再72 ℃延伸10 min。PCR产物经过电泳后切割电泳条带进行PCR产物胶回收，并连接于T19载体上，经感受态细胞转化后挑取阳性克隆，经过PCR确认阳性克隆后，送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。对测序结果的序列进行BLAST比对，经BLAST比對分析，把测序结果提交到GenBank，获登录号为MT645322。应用ClustalX 2.0.10、MEGAX等软件进行系统发育分析，用N-J法构建进化树。
1.2.5? ? 室内接菌。采集刚孵化聚集幼虫带回实验室，置于养虫笼，每日换1次新鲜重阳木嫩枝。室内温度控制在29～32 ℃之间，相对湿度为56%～70%。饲养7 d，当幼虫长度约0.5 cm时，选取活跃、大小一致重阳木锦斑蛾幼虫480头，均分为3份，分别置于3个规格为65 cm×65 cm×65 cm的养虫笼中，然后分别置于3个培养室内，设置3个接种处理，分别是菌液喷雾接种处理，即在分离纯化培养的寄生菌平板上刮取孢子，用蒸馏水10 mL浸泡、加一小滴吐温80后充分搅拌混匀，稀释至孢子浓度为106～108个/mL，用微量喷雾器于离虫体50 cm处均匀喷洒完;吹撒菌粉处理，即刮取大致与菌液配制相同的孢子量置于培养皿盖上，离虫体50 cm处用吸耳球均匀吹散孢子;空白对照（CK），即不做任何处理。每天定时清理养虫盒残渣，更换重阳木新鲜幼嫩枝叶，并详细记录重阳木锦斑蛾幼虫生长状况。寄生率及矫正寄生率计算公式如下：
寄生率（%）=被感染虫数/供试虫数×100;
矫正寄生率（%）=（接菌处理被感染虫数-对照处理被感染数）/供试虫数×100。
2? ? 结果与分析
2.1? ? 漯河市重阳木锦斑蛾发生现状
漯河市区重阳木行道树的路段重阳木锦斑蛾危害极为严重，常常造成叶片发黄、枝干变秃，呈夏季冬景，不仅降低观赏价值，而且严重影响城市绿化效果。老熟幼虫树上吐丝落地，对行人造成极大困扰，也使环卫工人的工作加重。2016年调查结果显示，人民路、黄河路虫口密度分别为1 952头/百叶和1 335头/百叶，重阳木锦斑蛾的危害情况较为严重。
2.2? ? 重阳木锦斑蛾幼虫寄生真菌的分离和形态观察
2016年7月20日在漯河市郾城区黄河路两旁采集到了重阳木锦斑蛾寄生真菌，如图1（a）所示。然后挑取少量在电子显微镜下观察分生孢子梗和分生孢子，并进行拍照记录，如图1（b）所示。用消毒好的解剖刀切去幼虫虫体上的寄生真菌菌丝，在PDA培养基上分离纯化形成的菌落拍照记录，如图1（c）所示，然后挑取少量在电子显微镜下观察，拍照记录。对比分离纯化前后照片，判定其为一种真菌，并记为CMY。
纯化后，培养物早期白色，随后呈绿色。经显微镜观察，分生孢子呈绿色，分生孢子梗是一根直立的菌丝，菌丝的末端形成球状顶囊，顶囊直径为21～48 μm，平均直径为39 μm，顶囊部分被初生小梗所覆盖。每个瓶梗向茎地产生一条球形、有色、不分隔的分生孢子链，分生孢子球形或近球形，直径为3.3～4.5 μm，平均直径为3.5 μm。
2.3? ? 寄生菌株的分子鉴定
以提取的CMY菌株基因组DNA为模板进行PCR获得了570 bp左右的产物（图2）。从系统发育分析结果来看，本研究中菌株MT645322与KX852295、MK-028959、MK989660、HQ28553、HQ285572、LC105697以及LT745394位于同一分支，均为Aspergillus flavus，序列相似性达99%以上（图3）。
2.4? ? 室内接种
接种处理后第13天开始出现僵虫（图4），到第16天达到高峰，第24天所有供试幼虫或寄生死亡，或非寄生死亡或开始化蛹。最后一批化蛹第7天再计数被寄生蛹虫数量，统计于被感染死亡虫数目中。
由表1可知，喷雾和孢子粉接种处理幼虫寄生率分别为49.4%和68.1%，明显高于空白对照（CK），且干孢子粉处理较喷雾处理幼虫寄生率高。喷雾和孢子粉接种处理的矫正死亡率分别为41.9%和60.6%。
3? ? 结论与讨论
重阳木锦斑蛾7—9月危害重，漯河地区1年发生3代，全年有世代重叠现象。近几年，重阳木锦斑蛾危害呈逐年严重趋势。目前，多采用苏云金杆菌、白僵菌粉剂与化学药剂结合喷杀低龄幼虫进行防治。
本研究中，自重阳木锦斑蛾僵虫分离得到的菌株CMY，从形态学和ITS序列分析确定为黄曲霉（Aspe-rgillus flavus）的一种。李文英等[16]报道，从罹病昆虫，如日本锤角叶蜂老熟幼虫（Cimbex japonca）、褐蚁（Lasius fuliginosus）、粟长蝽（Blissus pallipes）和棉蚜（Aphis go-ssypii）上分别分离出曲霉菌，并鉴定出黄曲霉（A. fla-vus）、黑曲霉（A. niger）、亮白曲霉（A. candidusk）和青霉状曲霉（A. penicilloides）等4个种，同时对其形态特征进行了详细描述，并对黄曲霉进行了致病试验。杨? 叶等[17]从自然死亡的瓜实蝇（Bactrocera cucurbitae）上分离到2株曲霉菌——黄曲霉（A. flavus）和溜曲霉（A. tamarii），二者对瓜实蝇成虫有较高的毒力。本研究中，在室内条件下，2种接种方式的寄生率明显高于不做任何处理的对照，可以明确分离到的黄曲霉（A. flavus）为重阳木锦斑蛾寄生菌。2种接种方法寄生率的差异及黄曲霉的安全性问题等有待于进一步研究。
4? ? 参考文献
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基金项目? ?河南省高等学校重点科研项目（16B10006）。
作者简介? ?洪权春（1962—），男，吉林珲城人，副教授。研究方向：生物防治。
收稿日期? ?2020-06-25
