实时荧光定量PCR技术在转基因食品检测领域中的应用
孙娜+张颖
利用基因工程技术对基因组的构成进行改变，将一些比较优良的外源基因导入植物、动物或者微生物的体内，使其遗传物质、性状、营养价值或者品质向人们所需要的目标进行改变，从而获得产品或者以其为原材料进行加工后得到的食品，称为转基因食品。目前，我国在转基因作物种植方面也加大了力度，转基因作物的种植项目已经增加至25个，但是转基因食品在安全方面的问题还没有被人们所接受，因此，必须要加强对转基因食品进行有效的标识管理，严格控制外源基因的含量，但是这些都需要准确有效的基因检测技术。目前，在转基因食品检测方面的检测技术主要有两方面，分别是对外源基因表达产物进行检测和直接检测外源基因，其中对外源基因序列的检测是目前比较常见的检测方式，主要的方法是PCR方法，这个方法是以核心作为基础。随着科学技术水平的不断提高，实时荧光定量PCR 技术也随之出现，其结合PCR技术和探针杂交技术的优点，具有很高的灵敏度，是传统PCR技术的100倍左右，其检测原理是通过探测PCR工程中荧光信号的变化情况来定量DNA模板量。
实时荧光定量PCR技术的涵义
实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光集团，利用荧光信号的变化来对整个PCR的反应过程进行实时监控，根据荧光信号的强弱来及时获得特异性扩增产物的量，然后根据标准曲线来进行定量的检测方法。实时荧光定量PCR技术可以对DNA模板进行定量分析，具有灵敏度高、特异性和可靠性强、污染小、准确率高等优点。
实时荧光定量PCR技术的基本原理。在检测过程中，随着PCR反应循环数增加，反应过程所产生的DNA拷贝数也不断增加指数方式增加，然后逐渐转入平台期，这个时候实时荧光定量PCR就会对整个PCR反应过程进行实时检测，荧光信息的变化情况经过电脑会自动绘成一条曲线，然后根据曲线中的指数期内的节点的PCR产物的量来判断DNA模板的含量。
荧光阈值是以PCR 反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号标准差的10倍，一般要判断荧光信号是否可信就要看测出的荧光信号是不是在荧光阈值以上，这样可以定义一个样本的Ct值，Ct指在PCR循环过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数，也就是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系， 起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准样品可作出标准曲线，因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
常用方法。实时荧光定量PCR技术在化學原理上可以分为两类，分别是非探针类和探针类；其中探针类是利用探针来指示扩增产物的增加，常用的方法有TaqMan探针法；非探针类是利用荧光染料来对扩增产物的增加进行实时监控，常用的有SYBR GreenⅠ检测法。
实时荧光定量PCR技术在转基因食品领域中的应用
定量分析策略。在实时荧光定量PCR技术中，模板定量方法主要有两种，分别是相对定量和绝对定量。（1）相对定量。主要是指在一定的样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化，相对定量又分为比较Ct值法和标准曲线法，主要是依据相对定量方法是否需要建立标准曲线来区分的。比较Ct值法是不需要建立标准曲线的，但是它的前提是以靶基因和内源控制物的扩增效率保持基本一致，效率的偏移将影响实际拷贝数的估计。这种方法计算出的相对定量结果通常比实际结果要高，误差较大。标准曲线法首先要准备好标准品，其中包括目的的基因和内参基因的标准品，然后根据设定的梯度进行准确的配比稀释，一般是以1/10的梯度倍比进行稀释，然后制成标准曲线，通过标准曲线得到目的基因和内参基因的值，并将这两个基因的比值作为定量的最后结果。这种方法所得出的结果根据某个参照物的量而言的，且这种方法制作起来比较简易，只需要知道标准品的稀释倍数就可以了。（2）绝对定量。主要是指已知的标准曲线来推算出未出的样本的定量。在使用这个方法时首先要克隆目的基因和参照基因的扩增片段，然后构建体外转录系统，通过体外转录获得已知拷贝数的标准品来构建标准曲线，这种方法具有 稳定、准确的优点。另外，如果要定量多种目的基因，就需要针对不同的目的基因制备不同的定量标准品，但是这样会影响到定量的效率。
选择目标序列。在转基因成本定量分析中通常选择转基因生物基因组中的外源序列作为目标序列，其中包括有启动子、终止子、目的基因等。根据检测的外源目标序列的不同分类，转基因食品在应用实时荧光定量PCR检测技术进行检测时有四种序列的检测，分别是通用序列检测、结构特异性序列检测、基因特异性序列检测和品系特异性序列检测。
通用序列检测包括有调控基础序列和抗性标记基因序列，最终检测特定转化的靶基因。例如针对转基因小麦品系中通用的ubiq-uitin启动子、NOS终止子以及标记基因bar基因进行定性筛选检测，同时用已知为单拷贝的Wx012基因作为内源特异参照基因，绘制内源基因和外源基因的标准曲线，建立了转基因小麦的RTQ-PCR 检测方法。由于相同的通用元件和标记基因被常用语多种转基因产品的研究和生产中，一般只能用于初步的筛选。
结构特异性序列是指在插入载体的外源基因间的2个元件的连接区域序列，这种方法具有相对较高的特异性，因而被广泛应用与转基因食品的检测中。但是在相同的转基因外源表达载体在转化过程中，可能会出现1个或者2个或者对个拷贝的形式插入不同或者相同的植物基因组中，从而形成不同的转基因品系，这些转基因品系都具有相同的农艺性状，所以说，这种方法在具有相同农艺性状的转基因植物和不同培育品系两者之间不能够得到很好区分。
基因特异性序列主要是指插入的外源特异性基础的内部的一段序列，这段序列可以是天然来源的基因序列，也可以是人工改进的序列。但是，由于相同的外源基因可能在相同或不同的植物中表达会形成新的具有相同农艺性状的品系或新的转基因植物，因此基因特异性检测方法在检测具有相同农艺性状的转基因植物及其品系时并不适用。
品系特异性序列是指插入的外源序列与植物基因组连接的边界序列。这种检测方法具有较高的特异性和准确性，主要是因为每一个转基因植物品系都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，且连接区序列是单拷贝。这种检测方法目前在转基因食品检测中的应用研究是最受关注和重视的，大多数的商品化转基因植物都建立了品系特异性检测方法，如转基因大豆品系（DP-305423-1[18]、GTS40-3-2[19]、DP-356043-5[20]）。
实时荧光定量PCR 技术在转基因食品检测领域中的问题与展望
实时荧光定量PCR技术的出现和应用解决了转基因食品检测中对于灵敏、准确和快速的要求，实时荧光定量PCR技术突破了传统检测技术中智能重点检测的局限，采用了全封闭管分析、利用电脑分析软件对PCR扩增产物进行实时监测和自动定量，从而提高了检测的灵敏度和精密度；实时荧光定量PCR技术在定量动态范围内高达5个数量级，并且得到的结果的重现性较好。由于实时荧光定量PCR技术中荧光探针针对靶序列设计，具有高特异性，可以快速进行定量PCR检测。但是实时荧光PCR技术在实际应用中也存在一些问题，如：在检测的过程中需要特殊的热循环仪器和试剂，导致检测的成本较高；同时在检测过程中会受到很多因素的影响，可能会导致定量结果出现误差较大的情况，如探针比例、同源和异源DNA背景、dNTP的浓度等。因此，针对这些问题，在实时荧光定量PCR技术的操作过程中必须充分验证所设计引物的特异性和优化反应条件。随着转基因检测技术的不断进步，在提高实时荧光定量PCR技术的靈敏度和重复性方面有多种技术并取得了明显的效果，从而使样品的制备更加简单和程序化。
随着我国基因工程技术的不断发展，在农业生产中也得到了广泛的应用，越来越多的改良特征转基因食品也随之出现并得到迅猛的发展，但是转基因食品的安全性还是目前我们所担忧的问题。为了保证转基因食品的安全性，制定了转基因产品标签制度，建立快速、准确、高通量的定量检测方法显得非常必要，是保证转基因产品标签制度顺利实施的基础，因而具备这些特点的实时荧光定量PCR 技术在转基因食品检测领域中的应用将会得到更大范围的普及。
实现转基因食品实时荧光定量检测首要面临的问题是构建相应品系的质粒标准品。在传统的标准品构建过程中，主要是以转基因材料与其对应的非转基因材料按一定的质量比例配制而成，从而获得一系列质量分数的标准品，再建立标准曲线来对样品进行相对定量检测，这种方法具有一定的局限性，除了目前市场上常用的转基因品系外，许多转基因品系的标准样品还难以得到。而随着转基因植物品系的日益增多，对于许多新增的转基因品系的标准样品的获得将更加困难，那么对于这些品种的检测就更加难以实现，使这些转基因食品的安全得不到保障，同时也在很大程度上限制了转基因生物研究和监管工作的发展。
此外，虽然实时荧光定量PCR 技术在转基因食品检测上突破了从定性到定量的界限，实现了精确定量到绝对定量的转变，但是随着全球生物技术的发展，很多复合型转基因植物也出现了，新的转基因植物趋向于复合基因改造，如以8 个基因为基础的Smartstax就是一种新型的复合性状生物技术玉米产品，是迄今最先进的获批的生物技术作物。同时，转基因食品的生产工艺也在逐渐改善和优化，食品加工过程原料中的转基因序列遭到严重破坏。这些都对实时荧光定量PCR检测技术提出了更高的要求和标准。
综上所述，实时荧光定量PCR技术是转基因食品检测领域的一种突破，可以更加快速、灵敏、准确的对转基因食品进行检测，提高转基因食品的安全性，在转基因食品检测领域中具有良好的应用和发展前景。
利用基因工程技术对基因组的构成进行改变，将一些比较优良的外源基因导入植物、动物或者微生物的体内，使其遗传物质、性状、营养价值或者品质向人们所需要的目标进行改变，从而获得产品或者以其为原材料进行加工后得到的食品，称为转基因食品。目前，我国在转基因作物种植方面也加大了力度，转基因作物的种植项目已经增加至25个，但是转基因食品在安全方面的问题还没有被人们所接受，因此，必须要加强对转基因食品进行有效的标识管理，严格控制外源基因的含量，但是这些都需要准确有效的基因检测技术。目前，在转基因食品检测方面的检测技术主要有两方面，分别是对外源基因表达产物进行检测和直接检测外源基因，其中对外源基因序列的检测是目前比较常见的检测方式，主要的方法是PCR方法，这个方法是以核心作为基础。随着科学技术水平的不断提高，实时荧光定量PCR 技术也随之出现，其结合PCR技术和探针杂交技术的优点，具有很高的灵敏度，是传统PCR技术的100倍左右，其检测原理是通过探测PCR工程中荧光信号的变化情况来定量DNA模板量。
实时荧光定量PCR技术的涵义
实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光集团，利用荧光信号的变化来对整个PCR的反应过程进行实时监控，根据荧光信号的强弱来及时获得特异性扩增产物的量，然后根据标准曲线来进行定量的检测方法。实时荧光定量PCR技术可以对DNA模板进行定量分析，具有灵敏度高、特异性和可靠性强、污染小、准确率高等优点。
实时荧光定量PCR技术的基本原理。在检测过程中，随着PCR反应循环数增加，反应过程所产生的DNA拷贝数也不断增加指数方式增加，然后逐渐转入平台期，这个时候实时荧光定量PCR就会对整个PCR反应过程进行实时检测，荧光信息的变化情况经过电脑会自动绘成一条曲线，然后根据曲线中的指数期内的节点的PCR产物的量来判断DNA模板的含量。
荧光阈值是以PCR 反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号标准差的10倍，一般要判断荧光信号是否可信就要看测出的荧光信号是不是在荧光阈值以上，这样可以定义一个样本的Ct值，Ct指在PCR循环过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数，也就是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系， 起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准样品可作出标准曲线，因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
常用方法。实时荧光定量PCR技术在化學原理上可以分为两类，分别是非探针类和探针类；其中探针类是利用探针来指示扩增产物的增加，常用的方法有TaqMan探针法；非探针类是利用荧光染料来对扩增产物的增加进行实时监控，常用的有SYBR GreenⅠ检测法。
实时荧光定量PCR技术在转基因食品领域中的应用
定量分析策略。在实时荧光定量PCR技术中，模板定量方法主要有两种，分别是相对定量和绝对定量。（1）相对定量。主要是指在一定的样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化，相对定量又分为比较Ct值法和标准曲线法，主要是依据相对定量方法是否需要建立标准曲线来区分的。比较Ct值法是不需要建立标准曲线的，但是它的前提是以靶基因和内源控制物的扩增效率保持基本一致，效率的偏移将影响实际拷贝数的估计。这种方法计算出的相对定量结果通常比实际结果要高，误差较大。标准曲线法首先要准备好标准品，其中包括目的的基因和内参基因的标准品，然后根据设定的梯度进行准确的配比稀释，一般是以1/10的梯度倍比进行稀释，然后制成标准曲线，通过标准曲线得到目的基因和内参基因的值，并将这两个基因的比值作为定量的最后结果。这种方法所得出的结果根据某个参照物的量而言的，且这种方法制作起来比较简易，只需要知道标准品的稀释倍数就可以了。（2）绝对定量。主要是指已知的标准曲线来推算出未出的样本的定量。在使用这个方法时首先要克隆目的基因和参照基因的扩增片段，然后构建体外转录系统，通过体外转录获得已知拷贝数的标准品来构建标准曲线，这种方法具有 稳定、准确的优点。另外，如果要定量多种目的基因，就需要针对不同的目的基因制备不同的定量标准品，但是这样会影响到定量的效率。
选择目标序列。在转基因成本定量分析中通常选择转基因生物基因组中的外源序列作为目标序列，其中包括有启动子、终止子、目的基因等。根据检测的外源目标序列的不同分类，转基因食品在应用实时荧光定量PCR检测技术进行检测时有四种序列的检测，分别是通用序列检测、结构特异性序列检测、基因特异性序列检测和品系特异性序列检测。
通用序列检测包括有调控基础序列和抗性标记基因序列，最终检测特定转化的靶基因。例如针对转基因小麦品系中通用的ubiq-uitin启动子、NOS终止子以及标记基因bar基因进行定性筛选检测，同时用已知为单拷贝的Wx012基因作为内源特异参照基因，绘制内源基因和外源基因的标准曲线，建立了转基因小麦的RTQ-PCR 检测方法。由于相同的通用元件和标记基因被常用语多种转基因产品的研究和生产中，一般只能用于初步的筛选。
结构特异性序列是指在插入载体的外源基因间的2个元件的连接区域序列，这种方法具有相对较高的特异性，因而被广泛应用与转基因食品的检测中。但是在相同的转基因外源表达载体在转化过程中，可能会出现1个或者2个或者对个拷贝的形式插入不同或者相同的植物基因组中，从而形成不同的转基因品系，这些转基因品系都具有相同的农艺性状，所以说，这种方法在具有相同农艺性状的转基因植物和不同培育品系两者之间不能够得到很好区分。
基因特异性序列主要是指插入的外源特异性基础的内部的一段序列，这段序列可以是天然来源的基因序列，也可以是人工改进的序列。但是，由于相同的外源基因可能在相同或不同的植物中表达会形成新的具有相同农艺性状的品系或新的转基因植物，因此基因特异性检测方法在检测具有相同农艺性状的转基因植物及其品系时并不适用。
品系特异性序列是指插入的外源序列与植物基因组连接的边界序列。这种检测方法具有较高的特异性和准确性，主要是因为每一个转基因植物品系都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，且连接区序列是单拷贝。这种检测方法目前在转基因食品检测中的应用研究是最受关注和重视的，大多数的商品化转基因植物都建立了品系特异性检测方法，如转基因大豆品系（DP-305423-1[18]、GTS40-3-2[19]、DP-356043-5[20]）。
实时荧光定量PCR 技术在转基因食品检测领域中的问题与展望
实时荧光定量PCR技术的出现和应用解决了转基因食品检测中对于灵敏、准确和快速的要求，实时荧光定量PCR技术突破了传统检测技术中智能重点检测的局限，采用了全封闭管分析、利用电脑分析软件对PCR扩增产物进行实时监测和自动定量，从而提高了检测的灵敏度和精密度；实时荧光定量PCR技术在定量动态范围内高达5个数量级，并且得到的结果的重现性较好。由于实时荧光定量PCR技术中荧光探针针对靶序列设计，具有高特异性，可以快速进行定量PCR检测。但是实时荧光PCR技术在实际应用中也存在一些问题，如：在检测的过程中需要特殊的热循环仪器和试剂，导致检测的成本较高；同时在检测过程中会受到很多因素的影响，可能会导致定量结果出现误差较大的情况，如探针比例、同源和异源DNA背景、dNTP的浓度等。因此，针对这些问题，在实时荧光定量PCR技术的操作过程中必须充分验证所设计引物的特异性和优化反应条件。随着转基因检测技术的不断进步，在提高实时荧光定量PCR技术的靈敏度和重复性方面有多种技术并取得了明显的效果，从而使样品的制备更加简单和程序化。
随着我国基因工程技术的不断发展，在农业生产中也得到了广泛的应用，越来越多的改良特征转基因食品也随之出现并得到迅猛的发展，但是转基因食品的安全性还是目前我们所担忧的问题。为了保证转基因食品的安全性，制定了转基因产品标签制度，建立快速、准确、高通量的定量检测方法显得非常必要，是保证转基因产品标签制度顺利实施的基础，因而具备这些特点的实时荧光定量PCR 技术在转基因食品检测领域中的应用将会得到更大范围的普及。
实现转基因食品实时荧光定量检测首要面临的问题是构建相应品系的质粒标准品。在传统的标准品构建过程中，主要是以转基因材料与其对应的非转基因材料按一定的质量比例配制而成，从而获得一系列质量分数的标准品，再建立标准曲线来对样品进行相对定量检测，这种方法具有一定的局限性，除了目前市场上常用的转基因品系外，许多转基因品系的标准样品还难以得到。而随着转基因植物品系的日益增多，对于许多新增的转基因品系的标准样品的获得将更加困难，那么对于这些品种的检测就更加难以实现，使这些转基因食品的安全得不到保障，同时也在很大程度上限制了转基因生物研究和监管工作的发展。
此外，虽然实时荧光定量PCR 技术在转基因食品检测上突破了从定性到定量的界限，实现了精确定量到绝对定量的转变，但是随着全球生物技术的发展，很多复合型转基因植物也出现了，新的转基因植物趋向于复合基因改造，如以8 个基因为基础的Smartstax就是一种新型的复合性状生物技术玉米产品，是迄今最先进的获批的生物技术作物。同时，转基因食品的生产工艺也在逐渐改善和优化，食品加工过程原料中的转基因序列遭到严重破坏。这些都对实时荧光定量PCR检测技术提出了更高的要求和标准。
综上所述，实时荧光定量PCR技术是转基因食品检测领域的一种突破，可以更加快速、灵敏、准确的对转基因食品进行检测，提高转基因食品的安全性，在转基因食品检测领域中具有良好的应用和发展前景。
