重组IFN-γ免疫后红鳍东方鲀免疫相关基因在肾组织中的表达分析

    孔德荣 孙鹤 李慧 王智诚 仇雪梅 刘海映 王秀利

    

    

    

    摘 要：?? 为探讨重组红鳍东方鲀（ Takifugu rubripes ）干扰素γ（rIFNg-γ）对机体的免疫应答，以不同浓度（25 μg/mL rIFNg-γ为实验组1、50 μg/mL rIFNg-γ为实验组2）的原核表达的IFN-γ重组蛋白免疫6月龄健康红鳍东方鲀，PBS作为对照组，于腹腔注射后6、12、24、36 h取肾脏组织。实时定量PCR检测肾组织IFN-α、IFN-γ、MHCⅠ、Mx1基因在肾脏组织不同时间表达量的差异。结果显示，红鳍东方鲀经rIFNg-γ免疫后6～36 h，IFN-α基因在实验组1中的表达呈现先上升后下降的趋势，24 h时表达量最高;在实验组2中的表达量在6 h最高，随后呈下降趋势。IFN-γ、MHCⅠ在免疫后6 h表达量都出现最大值且實验组1高于实验组2，随后呈下降趋势。Mx1基因的表达则出现上升趋势，24 h时表达量最高，随后下降。

    关键词： 红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）;肾脏;重组干扰素γ;免疫相关基因;基因表达

    我国养殖红鳍东方鲀（ Takifugu rubripes ）已有二十余年，人工繁殖、育苗、养成技术基本成熟。但随着红鳍东方鲀养殖规模及养殖密度的不断扩大，病害问题日趋严重，造成了较大的经济损失。尤其是细菌性疾病、病毒性疾病等 ?[1] 流行范围广、发生频繁、死亡率高，在一定程度上制约了红鳍东方鲀养殖业的发展。

    利用本课题组前期构建的原核表达系统并小批量制备的重组红鳍东方鲀IFN-γ，免疫红鳍东方鲀，检测免疫相关基因IFN-α、IFN-γ、MHCⅠ（主要组织相容性复合体I基因（ Major histocompatibility complex classⅠ，MHCⅠ））、Mx1（黏病毒耐药蛋白1）在肾组织的表达情况，为重组红鳍东方鲀IFN-γ作为鱼类免疫增强剂提供参考。

    1 材料与方法

    1.1 实验材料与实验设计

    实验用红鳍东方鲀购自大连天正实业有限公司养殖场，体重150±20 g，体长16～18 cm，实验前于连续充气的水槽中暂养2周，水温15～18 ℃，每天投饵2次，其他按常规管理。暂养后，红鳍东方鲀随机分成3组，每组75尾，以PBS（pH=7.4） 缓冲液为溶剂，将原核表达的红鳍东方鲀IFN-γ重组蛋白（rIFN-γ）制成终浓度分别为25 μg/mL、50 μg/mL的溶液。三组个体分别腹腔注射PBS缓冲液、25 μg/mL rIFNg-γ、50 μg/mL rIFNg-γ各200 μL，其中PBS组为阴性对照，25 μg/mL rIFNg-γ组为实验组1，50 μg/mL rIFNg-γ组为实验组2。处理后，分别于0、6、12、24、36 h取3个组红鳍东方鲀肾脏组织。将采取的肾组织样按照1：5（v/v） 比例放入RNA later中保存备用。

    1.2 实验药品

    RNAiso plus试剂，Taq酶、反转录试剂盒购自大连宝生物生物有限公司; DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程（上海）有限公司; ?TransStart ?Top Green qPCR Supermix 试剂盒等购自北京全式金生物科技公司。Ambion RNAlater 购自赛默飞世尔科技有限公司，其他分析纯药品等均购自大连辰钰生物公司。

    1.3 免疫基因及其引物设计

    以红鳍东方鲀β-actin基因作为内参基因，选取红鳍东方鲀IFN-α、IFN-γ、MHCⅠ、Mx等免疫基因，分析红鳍东方鲀注射重组IFN-γ蛋白后这些免疫基因表达量的变化情况。利用Primer 5进行内参基因和免疫基因的引物设计，设计好的引物由上海生物工程有限公司进行合成（表1）。

    1.4 总RNA的提取

    将同一组织、同一实验组、相同时间点的样品于液氮中混匀后充分研磨并分装，-80 ℃保存，用于总RNA提取实验。参照RNAiso plus说明书进行RNA提取。琼脂糖凝胶电泳初步测定总RNA完整性，分光光度计及Aligent2000测定总RNA浓度及纯度。

    1.5 反转录

    选取OD 260 /OD 280 =1.8～2.0的RNA作为反转录模板，利用反转录酶按照反转录试剂盒（大连宝生物生物有限公司）说明书进行反转录反应，获得cDNA第一链，具体反应体系（表2）及反应条件如下：

    反转录反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。

    1.6 实时定量PCR

    1.6.1 标准曲线的制作 ?以反转录后的cDNA为模板进行实时定量PCR实验。按照5点10倍稀释法将cDNA进行稀释用作制备标准曲线的模板。实验时选择标准曲线法，利用全式金 TransStart ? Top Green qPCR SuperMix试剂盒在ABI Step One Plus上进行PCR扩增反应，反应体系为20 μL：即模板1 μL，正反向引物各0.6 μL（引物浓度10 μm/L），buffer 10 μL，Dye 0.4 μL，Rnase Free dH2O 7.4 μL。每个样品3次重复，反应条件为：94 ℃，30 s;94 ℃，5 s;60 ℃，30 s。观察熔解曲线及标准曲线，确定Ct值。

    1.6.2 相对定量PCR及数据处理 ?取上述cDNA为模板，以β-actin基因为内参，进行相对定量PCR。反应体系与反应条件同1.6.1。采用2-△△Ct法计算同一基因在不同组织的表达情况，实验结束后将数据输出。

    2 结果与分析

    2.1 总RNA提取及反转录

    琼脂糖凝胶电泳初步检测总RNA提取效果，结果如图1所示，28 S、18 S条带清晰且28 S条带亮度约是18 S亮度的1～2倍。分光光度计测定组织总RNA OD 230nm 、 OD 260nm 、OD 280nm ，确定总RNA浓度（OD 260nm / OD 280nm =1.8～2.0） 及纯度（OD 260nm / OD 230nm =1.5～2.0） 满足后续实验要求。反转录反应将总RNA转变成cDNA第一链，琼脂糖电泳检测条带呈弥散状。

    2.2 实时定量PCR检测

    实时定量PCR制作β-actin、IFN-α、IFN-γ、MHCⅠ、Mx标准曲线和溶解曲线，结果显示5个基因的溶解曲线分别在88.27 ℃、85.13 ℃、87.82 ℃、82.25 ℃、83.54 ℃有单一峰且无杂峰，说明引物均具有良好的特异性，如图2所示，满足实时定量PCR的要求。

    观察各基因标准曲线，横坐标代表模板相对浓度即稀释倍数，纵坐标代表Ct值，反映了基因出现扩增时所经历的循环数。通过调整cDNA的浓度，各基因扩增效率均达到90%～110%，R 2均大于0.998，可以认为各基因与内参基因扩增效率一致，满足相对定量PCR中2 ?-△△Ct 法原理及要求。

    2.3 免疫基因的组织表达

    根据标准曲线中各免疫基因各cDNA浓度时Ct值的大小，选择10 ?-1 cDNA浓度为模板进行各免疫基因相对定量PCR实验（2 ?-△△Ct 法）。如图3所示，红鳍东方鲀免疫后6～36 h，IFN-α基因在实驗组1中的表达呈现先上升后下降的趋势，24 h时表达量最高;在实验组2中的表达量在6 h最高，随后呈下降趋势。IFN-γ、MHCⅠ基因在免疫后6 h表达量都出现最大值且实验组1高于实验组2，随后呈下降趋势。Mx基因的表达则出现上升趋势，24 h时表达量最高，随后下降。

     3 讨论

    经重组的红鳍东方鲀IFN-γ免疫后个体后，IFN-α基因的表达量在低剂量组中呈先上升后下降的趋势，在24 h表达量相对较高，而高剂量组中其在6h表达量最高，表明高剂量组效果更好。余新建等 ?[2] 利用重组Ⅰ型干扰素免疫健康草鱼，分别于免疫后6、12、24、48、72 h检测草鱼各免疫器官内干扰素系统基因的表达情况，结果表明Ⅰ型IFN表达在24～48 h达到峰值，该结果与本实验结果相似，但本实验IFN-α表达量在36 h出现下降，可能是由于重组蛋白浓度及活性下降引起的。

    IFN-γ的表达量在低剂量及高剂量组中均在6 h出现峰值，随后呈现下降趋势。该结果说明红鳍东方鲀受到重组IFN-γ蛋白免疫后，体内IFN-γ表达上调，经过一段时间后，免疫作用结束，IFN-γ表达逐渐恢复到本底水平。Jung ?[3] 等以10 ng/mL 和100 ng/mL牙鲆重组IFN-γ蛋白免疫其头肾细胞，体外培养后检测IL-1β、STAT1、CXCL13、IFN-γ在6 h、24 h的表达情况;结果显示高剂量组中IFN-γ基因在6 h表达量远远高于低剂量组和对照组，低剂量组在24 h时有显著性表达，该结果表明当重组蛋白浓度大于100 ng/mL时，可能会引起细胞内IFN-γ基因的大量表达。Biswas等（2015）以50 μg/mL浓度的重组蛋白免疫红鳍东方鲀检测机体内IFN-γ、IL-1β、IL-6等相关细胞因子在1 d、3 d、5 d时的表达情况，结果显示IFN-γ的表达没有显著性变化，而IL-1β、IL-6等细胞因子在1d、5d时的表达有显著性差异，猜测IFN-γ会刺激免疫因子的不持续性表达 ?[4] 。本实验中IFN-γ基因在高剂量组（50 μg/mL） 的表达量普遍低于低剂量组，可能是由于重组蛋白浓度过高抑制基因的短时间内的表达，对于其长远的影响需要进一步的研究探索。

    MHC为主要组织相容性复合体，在特异性免疫中发挥重要作用，鱼类与哺乳动物相同均含有两类MHC分子即MHCⅠ和MHCⅡ。当受到外源性物质（如病毒、细菌、其他抗原等）刺激后，机体各组织内的MHC分子会出现不同水平的上调。草鱼注射柱状黄杆菌后，其头肾中的MHCⅠ显著性上调 ?[5] 。牙鲆受爱德华氏菌感染后免疫器官中的两类MHC分子表达量均升高 ?[6] 。本实验中，两剂量组中MHCⅠ基因的表达量趋势一致，在6 h表达量最高，且低剂量组高于高剂量组，随后呈下降趋势。这种现象可能与MHCⅠ本身的作用机制有关。MHCⅠ的主要作用是将抗原呈递给CD +8T细胞，而CD +8T细胞具有具有抑制性T细胞和细胞毒性T细胞作用 ?[7] ，在识别外源抗体，细胞攻毒方面起着重要作用。此外MHCⅠ可通过免疫细胞广泛存在的模式识别信号通路而快速传递信息 ?[8] ，因此，在受到外源刺激后，红鳍东方鲀个体内MHCⅠ的表达量可能快速上调。

    Mx蛋白是一种由IFN诱导产生的GTP酶动力蛋白，目前，鱼类中已从大菱鲆 ?[9] 、大西洋鲑 ?[10] 、虹鳟 ?[11] 、鲶鱼 ?[12] 获得了具有抗病毒活性的Mx蛋白。研究表明，利用poly：C感染鲶鱼会引起Mx mRNA显著上调，肌肉注射后6 h出现转录水平的增加 ?[12] 。本实验中Mx基因表达量在免疫后6～24 h表现为上调状态，24 h表达量最大，总体呈现先上升后下降的趋势，低剂量组表达量总体高于高剂量组。本实验证明重组IFN-γ可以作用于红鳍东方鲀诱导其体内Mx基因的表达。以病毒感染鱼类，免疫印迹方式检测Mx蛋白在不同器官的表达情况，结果发现，免疫器官在病毒刺激后Mx蛋白表达量都会增加，但肝脏中Mx蛋白的表达量在注射处理后的第三天达到峰值，第14天仍保持上升状态 ?[13] ，表明Mx蛋白的表达量较为持久。

    利用鱼类的天然免疫基因生产和制备重组免疫因子作为免疫增强剂取代抗生素用于水产生物病害的防治是重要的研究内容和发展方向。本研究结果为今后进一步研究重组免疫因子在鱼类尤其是红鳍东方鲀病害防治上的应用提供了参考。

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