槟榔香六堡茶中香气成分提取方法的比较
黄林杰++罗达龙++钟家良++林冬杰
六堡茶，中国历史上著名的黑茶之一，是广西壮族自治区梧州市特色优势产业和知名农业品牌，也是广西重点发展产业之一，因产于苍梧县六堡镇而得名。“槟榔香”一直被认为是六堡茶的特有香气，也被看作是重要的品质特征，其需要在适宜的环境条件下，经过8～10年的陈化才能明显显现出来。近年来，随着“饮六堡”的兴起，人们对六堡茶“槟榔香”的关注度逐渐增多，“槟榔香”成为消费者追求的特征之一，也与六堡茶的价格有一定关联。目前，关于“槟榔香”的香气成分及数量，不同文献报道的差异较大，陈文品等人分别在农家六堡茶和精制六堡茶中共检出100种挥发性成分；李建勋等人初步鉴定出67种化合物；刘泽森等人鉴定出近66种挥发性成分。茶叶中的香气成分多而复杂，且含量较低微，易挥发不稳定，需要用到特殊的提取技术。本文以槟榔香六堡茶为对象，分别采用挥发油提取法、超声波提取法、HS-顶空法和ITEX-动态顶空法进行提取，用GC-MS进行分析，用NIST谱库进行目标化合物的判定，并用峰面积归一化法计算各组分的相对含量，从而探讨不同方法间的差异度，确定一种快速、准确、环保的提取槟榔香六堡茶中香气成分的检测手段。
材料及方法
材料。“槟榔香”六堡茶共10批，来自于梧州辖区内5家大型六堡茶生产企业，确保样品具有代表性。 氯化钠（分析纯，由广东光华科技股份有限公司提供），乙酸乙酯（分析纯，由成都市科龙化工试剂厂提供），水为超纯水（实验室自制）。
仪器。 CTC-动态顶空ITEX；GC-7890B/QQQ-7000C气质联用仪（美国Agilent公司）；NIST2014数据库（美国Agilent）；德国Elmasonic P超声波（德国Elma公司）；挥发油提取装置一套。
方法。
（1）挥发油提取法（方法1）
采用挥发油提取装置，取茶样30.0 g，分别进行挥发油提取，直至香精油不再增加（约5小时），将香精油转移至250ml容量瓶中，并加乙酸乙酯至刻度，摇匀。再精密吸取1ml，置10ml容量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，摇匀。
（2）超声波提取法（方法2）
取茶样30.0g，分别加入250ml乙酸乙酯，超声条件参考相關文献：频率37kHz，功率100W，温度70℃，提取时间1h，再精密吸取1ml，置10 ml容量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，摇匀。
（3）HS-顶空法（方法3）
取茶样6.0g于烧杯中，分别加入25ml沸水，加盖保温15min，过滤，取6ml茶汤于已加入1.9g氯化钠的顶空瓶中，压盖密封即得。
（4）ITEX-动态顶空法（方法4）
同方法三。
仪器分析条件。
HS条件：平衡温度：80℃，平衡时间：600s，振荡速度：500r/min，进样针温度：85℃， 抽提体积：1ml，抽提速度：200μl/s，洗针时间：300s，GC准备时间：3420s。
Itex条件：平衡温度：80℃，平衡时间：600s，振荡速度：500r/min，进样针温度：85℃， 抽提体积：1ml，抽提次数：5次，抽提速度：200μl/s，解析温度：230℃，解析速度：20μl/s，洗针温度：250℃，洗针时间：300s。
色谱条件：Agilent HP-5MS毛细管色谱柱（30m×250μm×0.25μm）；载气：He（纯度：99.999%），流速：1.5ml/min，分流比：50：1，进样口温度：100℃；柱温：起始温度40℃，保持3min，然后以3℃/min速率升温至180℃，再以8℃/min升温至250℃。
质谱条件：接口温度280℃，离子源温度：230℃，离子源：EI，电子能量：70eV，扫描质量范围：45～500amu，扫描模式：全扫描。
进样方式及进样量：方法1、2为液体进样，进样量为1μl；方法3、4为顶空气体进样，进样量分别为1000μl和200μl。
GC-MS分析。茶样经过不同方法提取后，经GC-MS分析，全扫描采集，得到总离子流图，采用NIST2014谱库进行检索，结合匹配度、提取离子和碎片离子相对丰度进行目标化合物的判定，初步得到各方法提取的主要香气成分，并以峰面积归一化法计算这些成分的相对含量。
结果分析与讨论
4种提取方法的结果分析。 对所有茶样提取后进行检测分析，NIST 2014谱库匹配度在85以上并能确证的香气成分，以方法1检出的最多，共有44种，其次为方法4（40种）、方法2（34种）和方法3（26种），各成分的平均相对含量见表1，包括醇类、醛类、酮类、酯类、碳氢类、萘及化合物和杂氧化合物。各类含量不同方法间存在一定的差异，见表2。以含量超过10%的大类来看，醇类物质占总香气含量的比例在4种方法中均是最高的，其中又以方法4的醇类含量最高，方法1略低；方法1得到的醇类最多，共有10种。有研究认为，醇类物质是槟榔香的主要成分，香气种类及含量均居各类物质之首，其气味似淡雅果香，一般多出现在陈年六堡茶中，如检出的α-雪松醇、β-芳樟醇、α-萜品醇等，具有木香或花果香，就类似槟榔香的香气。碳氢类的含量仅次于醇类，主要包括α-雪松烯、δ-杜松烯等倍半萜烯类，这些物质普遍带有木香，与六堡茶的陈香有关。酯类和萘及化合物类的含量均接近或超过10%，这两类分别具有香油味和花香味，均为不可忽视的香气成分。
4种提取方法的比较。从提取时间上来看，方法3、4均为15min，方法2需要60min，方法1时间最长，不低于5h（即300min）；从操作简易度来说，很明显后3种方法更简便，方法1受仪器装置的限制，不适宜进行大批量的提取；从环保和节约的角度出发，方法1、2需要大量的乙酸乙酯，而方法3、4只需要沸水浸泡即可上机，实现了无溶剂化，减轻了污染，降低了成本；从保持茶叶原味上说，方法1、2因为加入了有机溶剂，对香气的气味会有一定影响，而方法3、4采用直接冲泡，更能保持茶叶的原香；从提取效率上看，不同提取方法对香气的影响主要表现在数量、相对含量以及香气类型是否与“槟榔香”相符等几个因素。从2.1结果看，在香气数量上，方法1>方法4>方法2>方法3，相对含量（醇类）：方法4>方法1>方法2>方法3，相对含量（碳氢类）：方法2>方法1>方法4>方法3，相对含量（酯类）：方法4>方法2>方法1>方法3，相对含量（萘及化合物）：方法4>方法3>方法2>方法1。
综上所述，4种方法对槟榔香六堡茶香气成分的影响存在较大差异，评价方法是否适用，除了考虑获得的香气总量、组分数及含量外，还得分析各组分是否符合“槟榔香”似花果香、陈香的特性。从本文可知，挥发油提取法虽然提取成分最多，但耗时最长，需要用到有机溶剂，对挥发性组分有一定影响，且不适用于大批量提取。超声提取和HS-顶空法提取成分较少，且主成分含量不高。ITEX-动态顶空法作为一种较新型的提取技术，具有快速、环保、主成分提取效率高等特点，且能最大程度的保持六堡茶的茶香味，目前逐渐成为茶叶中香气提取的主要方法。
六堡茶，中国历史上著名的黑茶之一，是广西壮族自治区梧州市特色优势产业和知名农业品牌，也是广西重点发展产业之一，因产于苍梧县六堡镇而得名。“槟榔香”一直被认为是六堡茶的特有香气，也被看作是重要的品质特征，其需要在适宜的环境条件下，经过8～10年的陈化才能明显显现出来。近年来，随着“饮六堡”的兴起，人们对六堡茶“槟榔香”的关注度逐渐增多，“槟榔香”成为消费者追求的特征之一，也与六堡茶的价格有一定关联。目前，关于“槟榔香”的香气成分及数量，不同文献报道的差异较大，陈文品等人分别在农家六堡茶和精制六堡茶中共检出100种挥发性成分；李建勋等人初步鉴定出67种化合物；刘泽森等人鉴定出近66种挥发性成分。茶叶中的香气成分多而复杂，且含量较低微，易挥发不稳定，需要用到特殊的提取技术。本文以槟榔香六堡茶为对象，分别采用挥发油提取法、超声波提取法、HS-顶空法和ITEX-动态顶空法进行提取，用GC-MS进行分析，用NIST谱库进行目标化合物的判定，并用峰面积归一化法计算各组分的相对含量，从而探讨不同方法间的差异度，确定一种快速、准确、环保的提取槟榔香六堡茶中香气成分的检测手段。
材料及方法
材料。“槟榔香”六堡茶共10批，来自于梧州辖区内5家大型六堡茶生产企业，确保样品具有代表性。 氯化钠（分析纯，由广东光华科技股份有限公司提供），乙酸乙酯（分析纯，由成都市科龙化工试剂厂提供），水为超纯水（实验室自制）。
仪器。 CTC-动态顶空ITEX；GC-7890B/QQQ-7000C气质联用仪（美国Agilent公司）；NIST2014数据库（美国Agilent）；德国Elmasonic P超声波（德国Elma公司）；挥发油提取装置一套。
方法。
（1）挥发油提取法（方法1）
采用挥发油提取装置，取茶样30.0 g，分别进行挥发油提取，直至香精油不再增加（约5小时），将香精油转移至250ml容量瓶中，并加乙酸乙酯至刻度，摇匀。再精密吸取1ml，置10ml容量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，摇匀。
（2）超声波提取法（方法2）
取茶样30.0g，分别加入250ml乙酸乙酯，超声条件参考相關文献：频率37kHz，功率100W，温度70℃，提取时间1h，再精密吸取1ml，置10 ml容量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，摇匀。
（3）HS-顶空法（方法3）
取茶样6.0g于烧杯中，分别加入25ml沸水，加盖保温15min，过滤，取6ml茶汤于已加入1.9g氯化钠的顶空瓶中，压盖密封即得。
（4）ITEX-动态顶空法（方法4）
同方法三。
仪器分析条件。
HS条件：平衡温度：80℃，平衡时间：600s，振荡速度：500r/min，进样针温度：85℃， 抽提体积：1ml，抽提速度：200μl/s，洗针时间：300s，GC准备时间：3420s。
Itex条件：平衡温度：80℃，平衡时间：600s，振荡速度：500r/min，进样针温度：85℃， 抽提体积：1ml，抽提次数：5次，抽提速度：200μl/s，解析温度：230℃，解析速度：20μl/s，洗针温度：250℃，洗针时间：300s。
色谱条件：Agilent HP-5MS毛细管色谱柱（30m×250μm×0.25μm）；载气：He（纯度：99.999%），流速：1.5ml/min，分流比：50：1，进样口温度：100℃；柱温：起始温度40℃，保持3min，然后以3℃/min速率升温至180℃，再以8℃/min升温至250℃。
质谱条件：接口温度280℃，离子源温度：230℃，离子源：EI，电子能量：70eV，扫描质量范围：45～500amu，扫描模式：全扫描。
进样方式及进样量：方法1、2为液体进样，进样量为1μl；方法3、4为顶空气体进样，进样量分别为1000μl和200μl。
GC-MS分析。茶样经过不同方法提取后，经GC-MS分析，全扫描采集，得到总离子流图，采用NIST2014谱库进行检索，结合匹配度、提取离子和碎片离子相对丰度进行目标化合物的判定，初步得到各方法提取的主要香气成分，并以峰面积归一化法计算这些成分的相对含量。
结果分析与讨论
4种提取方法的结果分析。 对所有茶样提取后进行检测分析，NIST 2014谱库匹配度在85以上并能确证的香气成分，以方法1检出的最多，共有44种，其次为方法4（40种）、方法2（34种）和方法3（26种），各成分的平均相对含量见表1，包括醇类、醛类、酮类、酯类、碳氢类、萘及化合物和杂氧化合物。各类含量不同方法间存在一定的差异，见表2。以含量超过10%的大类来看，醇类物质占总香气含量的比例在4种方法中均是最高的，其中又以方法4的醇类含量最高，方法1略低；方法1得到的醇类最多，共有10种。有研究认为，醇类物质是槟榔香的主要成分，香气种类及含量均居各类物质之首，其气味似淡雅果香，一般多出现在陈年六堡茶中，如检出的α-雪松醇、β-芳樟醇、α-萜品醇等，具有木香或花果香，就类似槟榔香的香气。碳氢类的含量仅次于醇类，主要包括α-雪松烯、δ-杜松烯等倍半萜烯类，这些物质普遍带有木香，与六堡茶的陈香有关。酯类和萘及化合物类的含量均接近或超过10%，这两类分别具有香油味和花香味，均为不可忽视的香气成分。
4种提取方法的比较。从提取时间上来看，方法3、4均为15min，方法2需要60min，方法1时间最长，不低于5h（即300min）；从操作简易度来说，很明显后3种方法更简便，方法1受仪器装置的限制，不适宜进行大批量的提取；从环保和节约的角度出发，方法1、2需要大量的乙酸乙酯，而方法3、4只需要沸水浸泡即可上机，实现了无溶剂化，减轻了污染，降低了成本；从保持茶叶原味上说，方法1、2因为加入了有机溶剂，对香气的气味会有一定影响，而方法3、4采用直接冲泡，更能保持茶叶的原香；从提取效率上看，不同提取方法对香气的影响主要表现在数量、相对含量以及香气类型是否与“槟榔香”相符等几个因素。从2.1结果看，在香气数量上，方法1>方法4>方法2>方法3，相对含量（醇类）：方法4>方法1>方法2>方法3，相对含量（碳氢类）：方法2>方法1>方法4>方法3，相对含量（酯类）：方法4>方法2>方法1>方法3，相对含量（萘及化合物）：方法4>方法3>方法2>方法1。
综上所述，4种方法对槟榔香六堡茶香气成分的影响存在较大差异，评价方法是否适用，除了考虑获得的香气总量、组分数及含量外，还得分析各组分是否符合“槟榔香”似花果香、陈香的特性。从本文可知，挥发油提取法虽然提取成分最多，但耗时最长，需要用到有机溶剂，对挥发性组分有一定影响，且不适用于大批量提取。超声提取和HS-顶空法提取成分较少，且主成分含量不高。ITEX-动态顶空法作为一种较新型的提取技术，具有快速、环保、主成分提取效率高等特点，且能最大程度的保持六堡茶的茶香味，目前逐渐成为茶叶中香气提取的主要方法。
