褐藻多糖体外免疫调节活性研究
李俊燕 孙可澄 辛泉伯 罗薇 宋悦凡
摘要：以甘露糖醛酸多糖和岩藻聚糖硫酸酯为实验材料，通过酸水解法得到不同的聚甘露糖醛酸组分；采用超声法对岩藻聚糖硫酸酯进行降解，收集不同分子量范围区间的组分，对各样品进行红外光谱分析，并考察了体外对RAW264.7细胞活力的影响，以探索各组分的体外免疫调节活性。实验结果表明，采用三氟乙酸对甘露糖醛酸多糖进行水解，其红外谱图与水解前有明显变化，出现酯基吸收峰，表明水解程度较高；而醋酸水解后红外吸收谱图峰型无显著变化；采用凝胶排阻层析进行分子量检测，各组水解后的聚甘露糖醛酸分子量有不同程度降低。岩藻聚糖硫酸酯经超声处理后，分子量>100kD的组分在2μg/mL浓度下具有提高RAW264.7活性的作用，而浓度上升至54、162μg/mL时对细胞活性有抑制作用；而水解后所得的聚甘露糖醛酸各样品对RAW264.7活性无显著影响。
关键词：聚甘露糖醛酸；岩藻聚糖硫酸酯；免疫调节；生物活性
全世界海洋中生长有15000余种海藻，海洋藻类植物十分丰富。多糖是海藻最重要的产物，约占其干重的50%以上。海藻多糖是一种高分子碳水化合物，由多个不同或相同的单糖基通过糖苷键相连而成，并且它也是一种具有调节机体免疫功能作用的天然的活性物质，它通过调节机体免疫系统功能可以增强机体免疫活性，另外还具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗辐射和抗凝血等作用。
免疫系统是一套复杂的调控网络，在控制感染、预防慢性疾病和肿瘤的形成中发挥核心作用，具有免疫调节活性的天然产物的开发日益受到重视。广泛存在于动物、植物和微生物中的多糖是具有免疫调节活性的天然产物的重要来源，能够参与机体多种生理过程的调节，具有安全、毒副作用小等特点。本次实验旨在探索褐藻多糖的免疫调节活性，为未来的褐藻多糖功能产品的开发奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1生物材料 甘露糖醛酸多糖及岩藻聚糖硫酸酯由大连海洋大学食品科学与工程学院，国家海藻加工技术研发分中心提供；RAW 264.7细胞由中国科学院大连化学物理研究所提供。
1.1.2试剂 R/MINI 1640培养基，胎牛血清，青霉素，链霉素，二甲基亚砜（DMSO），胰酶购自上海生工。冰醋酸，三氟乙酸（TFA），四甲基偶氮唑盐（MTT），溴化钾，无水乙醇，三羟甲基氨基甲烷（Tris）等试剂均为市售分析纯。
1.2方法
1.2.1酸解法制备褐藻胶聚甘露糖醛酸 分别称取50mg甘露糖醛酸多糖6份，配制8.5mol/L醋酸溶液，4m01/L三氟乙酸溶液，加样如表1所示。摇匀，放人70℃电热恒温鼓风干燥箱水解4h后，取出，冷却至室温，4℃过夜后，将样品放人70℃电热真空干燥箱中，使溶剂挥发，加入去离子水，摇匀，再次放人70℃电热真空干燥箱中挥发，重复2～3次，pH试纸检测约为6.0，取出备用。
1.2.2超声法制备不同分子量区间的岩藻聚糖硫酸酯 称取80mg日本厚叶海带岩藻聚糖硫酸酯于50mL离心管中，加入去离子水20mL，摇匀，用超声波细胞粉碎机进行超声，超声波粉碎机设定强度为99%，温度为50℃，超声波工作时间4s，间隔9s，总时长60min。将超声后的样品依次转入100kD、50kD超滤管中，9000r/min，离心20min，收集分子量>100kD和100～50kD多糖组分，冷冻干燥，备用。
1.2.3各组分红外光谱检测 称取经干燥后的褐藻多糖样品1.8～2.8mg，分别加入溴化钾，烘干至恒重后，研磨均匀，压片后经傅立叶变换红外光谱仪（PerkinElmer股份有限公司）扫描4000～450cm-1波数范围。
1.2.4凝胶排阻层析法测定褐藻多糖的分子量 使用AKTA（UPC10）系统，采用Sephacryl S-100填料，色谱柱直径1cm，高度36cm，流动相为8mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH=8.0），分别称取褐藻多糖样品2～3mg，溶于Tris-HCl缓冲液，得浓度为2mg/mL的褐藻多糖溶液，上样，检测各样品的出峰位置。测定分子量所用的标准品分别为蓝色葡聚糖（分子量>2000kD）和葡萄糖标准品（分子量分别为5、40、70kD）。流动相流速为0.3mL/min，记录外水体积V。和洗脱体积Ve2，以Kav为横坐标（Kav=（Ve-Vo）/（V-Vo）），葡萄糖标准品分子质量对数为纵坐标，建立标准曲线，根据标准曲线计算褐藻多糖的分子量。
1.2.5MTT测定褐藻多糖对小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7活性的影响 选取RAW264.7细胞使用R/MINI-1640培养基培养，各培养基均加入10%小牛血清。取细胞株对数期生长细胞，使用培养基调整细胞浓度至2×105个/mL，96孔板每孔接种100μL，待96孔板中细胞接种约4h贴壁后，加入含多糖样品的培养基100μL，使得各多糖组分的终浓度分别为2、6、18、54、162μg/mL，同時设置只加入培养液的空白对照组，置于含5%CO2的培养箱中，37℃培养18h后，各孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，孵育4h后弃上清，加入150μLDMSO裂解，使用酶标仪双波长测定各孔吸光值，检测波长570nm、参比波长630nm。以对照组OD值为100%细胞活力，计算多糖样品各浓度下的细胞活力，采用t一检验法，P值取0.05时，与对照组比较不同多糖对RAW264.7细胞活力的影响是否显著。
2结果与分析
2.1聚甘露糖醛酸和岩藻聚糖硫酸酯组分的制备
酸解制备的聚甘露糖醛酸样品，经过多次加入去离子水，真空干燥，最终样品均为黑褐色固体，pH值约为6。超声粉碎冻干后的岩藻聚糖硫酸酯，分子量区间>100kD的样品重量为5.2mg，分子量区间在100～50kD的样品重量为2.3mg。两种组分总回收率为9.4%。
2.2聚甘露糖醛酸组分的红外光谱分析
初始的甘露糖醛酸多糖样品红外光谱图如图1所示，6种经降解后的聚甘露糖醛酸样品的红外光谱图，如图2-图3所示。
未经酸解的甘露糖醛酸多糖在3310cm-1处出现O-H伸缩振动的吸收峰，为多糖的一OH特征吸收峰，在1616cm-1处出现酰胺基C=O伸缩振动吸收峰，在1414cm-1处出现C-H变角振动吸收峰，在1030cm-1处出现C-O-C、C-O-H伸缩振动吸收峰。
经1、2、4mol三氟乙酸降解后所得的聚甘露糖醛酸均表现为相似的出峰位置，其中包括在3369～3402cm-1处出现O-H伸缩振动的吸收峰，为多糖的-OH特征吸收峰，在1685cm-1处出现C=O伸缩振动的吸收峰，存在部分内酯，在1416cm-1处出现C-H变角振动，在1040～1085cm-1处出现C-O-C、C-O-H伸缩振动吸收峰。
经2.125、4.25、8.5tool醋酸水解后所得的聚甘露糖醛酸均表现为相似的出峰位置，其中包括在3341～3350cm-1处出现O-H伸缩振动吸收峰，为多糖的-OH特征吸收峰，在1615cm-1处出现酰胺基C=O伸缩振动吸收峰，在1414cm-1处出现C-H变角振动吸收峰，在1035cm-1处出现C-O-C、C-O-H伸缩振动吸收峰。
对比原样品与降解后的样品发现：三氟乙酸水解后的聚甘露糖醛酸样品都在1685cm-1处出现羧基的吸收峰，峰值偏1700cm-1，有部分酯基，存在部分内酯，说明样品水解程度高。醋酸水解的聚甘露糖醛酸样品与水解前样品相似，说明醋酸的水解作用弱。同种酸不同浓度水解的样品红外谱图相似，说明在该水解温度和作用时长条件下，酸浓度对水解程度的影响较为有限。
2.3不同聚甘露糖醛酸降解组分的分子量检测
将不同的聚甘露糖醛酸进行凝胶排阻层析，依据葡萄糖标准品测定其各自的分子量，所得结果如下：初始甘露糖醛酸多糖样品分子量为22.72kD；以1、2、4mol三氟乙酸水解的聚甘露糖醛酸分子量分别为6.91kD、8.58kD、7.17kD；以2.125、4.25、8.5mol醋酸水解的聚甘露糖醛酸分子量分别为14.83kD、11.51kD、11.87kD。可知：经三氟乙酸水解后的聚甘露糖醛酸分子量较小，水解的较为彻底；而经醋酸水解后的聚甘露糖醛酸分子量较大。
2.4各多糖组分体外对RAW264.7细胞活力的影响
6种经降解后的聚甘露糖醛酸样品对RAW264.7细胞活力的影响结果，如图4-图5所示。6种聚甘露uW264.7细胞活力无明显影响，并无体外免疫细胞活性调节作用。
分子量>100kD的岩藻聚糖硫酸酯对RAW264.7细胞活力的影响结果，如图6所示。分子量>100kD的岩藻聚糖硫酸酯样品的浓度在2、54、162g/mL时，与对照组相比有显著性差异，2μg/mL浓度时显著刺激细胞活力上升，54、162μg/mL显著抑制细胞活性，说明分子量>100kD的岩藻聚糖硫酸酯体外具有免疫调节作用，在低浓度下对RAW264。7细胞活力有促进作用，而在高浓度下对RAW264.7细胞活力有抑制作用。50～100kD的岩藻聚糖硫酸酯样品与对照组相比无显著性差异。
3讨论
褐藻多糖虽然在组成和化学结构上存在差异，但在生物活性方面有很多的相似性，2013年，李海花等观察研究了重均分子量为5.5kD的低聚甘露糖醛酸对小鼠免疫系统的作用，结果表明，低聚甘露糖醛酸能提高机体的细胞免疫和体液免疫水平，具有显著的免疫调节作用。而本实验采用体外RAW264.7細胞培养，结果表明，聚甘露糖醛酸在体外条件下对免疫细胞并没有刺激或抑制作用，表明多糖在体内和体外免疫调节活性考察时，可能出现不同结果。
2016年，刘晓东等研究了岩藻聚糖硫酸酯对小鼠免疫的影响，结果表明，褐藻多糖硫酸脂在小鼠体内能不同程度地诱导细胞因子的产生，促进细胞免疫反应。本实验分子量>100kD的岩藻聚糖硫酸酯对细胞活力有显著性影响，低浓度下有提高细胞活性的作用，高浓度则起到抑制作用，故岩藻聚糖硫酸酯具有免疫调节活性，结果与刘晓东等研究结果相似。聚甘露糖醛酸的体内免疫调节活性和岩藻聚糖硫酸酯免疫调节活性的机理值得进行深入研究和探索。
（收稿日期：2017-12-05）
