患病鲫病原的确定与药物治疗效果
史谢尧 张振国 郝爽 黄俊岭 罗璋 冯守明
摘 要：2017年7月，天津某鲫鱼养殖场发生病害，患病鲫主要症状为头部发黑，体表出血。为分析其病因，通过寄生虫检测、病毒检测、病原菌分离和鉴定、药物敏感性测定等方法对患病鱼及病原进行了研究。结果表明：从患病鱼体表和体内未发现大量寄生虫；未能检测到疱疹病毒II型阳性；但从肾脏和脾脏组织分离到大量细菌。经鉴定为温和气单胞菌；该分离株对盐酸土霉素、盐酸四环素和氟苯尼考等3种药物较为敏感，选择盐酸土霉素作为治疗药物，按25.0 mg/kg鱼体重的用药量拌和在饲料中进行投喂，每天投喂1次，连续投喂5 d，取得了较好的治疗效果。
关键词：鲫；温和气单胞菌；药物敏感性；治疗
鲫具有肉质鲜嫩，抗逆性强，适应集约化养殖等特点而深受养殖者喜爱，是我国主要的淡水养殖品种之一，2016年全国养殖产量达291.2万吨[1]。随着鲫养殖规模的不断扩大，养殖产量的稳步上升，各种病害的大规模暴发已经成为了鲫健康发展的制约因子。迄今为止，鲫的多种生物性病原被报道，包括病毒性病原鲤疱疹病毒I型（Cyprinid herpesvirus I，CyHV-I）和鲤疱疹病毒II型（Cyprinid herpesvirus II，CyHV-II）[2-4]；细菌性病原嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、苏伯利亚气单胞菌等[3-5]；以及车轮虫、孢子虫等寄生虫病原和真菌性病原[6-8]。病原的多样化给鲫病害的防治带来困难，特别少数不同的病原引起鲫的发病症状极为相似，例如气单胞菌引起的细菌性败血症和鲤疱疹病毒II型引起的鲫疱疹病毒病都能导致鲫体表出血[4，9]，仅凭肉眼观察很难判断病原，给鲫疾病的诊治增加了难度。为了对疾病进行有效防控，在疾病发生后及时查找病原，筛选有效药物进行治疗显得尤为重要。
2017年7月上旬，天津武清地区某鲫鱼养殖池塘发生疾病，典型症状为头部发黑、体表出血、黏液增多、鳞片松动，该疾病发展速度快、死亡率高，给养殖者带来了较大的经济损失。为了尽快采取合理措施控制疾病的蔓延，作者等对病原进行了分析，开展了药敏性试验，根据试验结果选择药物进行了野外治疗试验，取得较好的治疗效果。
1 材料与方法
1.1 病原菌的分离和寄生虫观察
用75%酒精棉球反复擦拭病鱼体表后，在无菌条件下对病鱼进行解剖，用接种环分别从患病鱼的肾、肝、脾等组织取少量样品划线接种于LB平板和BHI平板，28 ℃培育48 h后，选取优势菌落进行纯化，直至获得纯培养JY-201705菌株后，将其保存、备用；同时，取患病鱼的鳍条、鳃、黏液、肠黏膜等样本在显微镜下进行寄生虫检查。
1.2 病毒的检测
取患病鲫的鳃、肾、脾、肝、脑组织混合后匀浆，使用DNA提取试剂盒按照说明书提取DNA。用套式PCR的方法对鲤疱疹病毒II型（Cyprinid herpesvirus 2， CyHV-2）进行检测（引物序列见表1）[9]。PCR反应体系为：DNA模板0.5 μL，上下游引物各0.2 μL（10 μmol/L），2 × Mix 10 μL，加双蒸水至20 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min后进行以下循环，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环，最后72 ℃延伸10 min。
1.3 病原菌的鉴定
1.3.1 形态学观察 将分离纯化后的JY-201705菌株划线接种于LB平板，28℃培养24 h至长出均匀菌落后，观察其菌落形态。并挑取少量菌苔做革兰氏染色涂片，利用光学显微镜观察染色特性和菌体形态。
1.3.2 全自动细菌鉴定仪鉴定 按GN试剂卡片说明书操作。
1.3.3 分子生物学方法鉴定 按参考文献[10]的方法进行，提取菌株JY-201705的基因组DNA为模板，采用细菌16S rRNA序列扩增的通用引物（表1）进行PCR扩增（反应体系和程序参照12）。将PCR产物切胶回收，连接PMD-18T载体后，转E.coil TOP10感受态细胞，挑取阳性克隆进行测序，测序结果与所有已登录GenBank的基因片段进行同源性比对得到相应的属种信息，并从GenBank中下载相近种的16S rRNA序列，利用软件MEGA5.0进行多序列匹配排列，采用邻位相连法（ Neighbor-joining） 构建系统发育树，Bootstraps重复检验1 000次。
1.4 药物敏感性测定
1.4.1 待测细菌的准备 将从患病鲫上分离到的JY-201705菌株接种在LB培养基中，28 ℃ 150 r/min培养48 h后，6 000 g离心10 min收集菌体，用0.75%的灭菌生理盐水将菌液浓度调整至1×107 CFU/mL，备用。
1.4.2 供试药物的选择 选择硫酸新霉素、硫酸庆大霉素、硫酸链霉素、盐酸土霉素、盐酸四环素、氟苯尼考、恩诺杀星、诺氟杀星、氨苄青霉素、硫酸卡那霉素等10种药物进行药敏试验。
1.4.3 最小抑菌浓度（MIC）的测定 参照陈昌福等[11]的方法进行。将各种药物分别用适宜介质溶解后，用0.75%灭菌生理盐水按2倍稀释法将各种药物浓度稀释至1 000.0～0.25 μg/mL等13个浓度。然后用灭菌后的LB培养基将各浓度的药物稀释10倍，使药物浓度稀释至100.0～0.025 μg/mL等13个浓度。在盛有3.0 mL 含不同浓度药物的LB培养基的试管中分别加入100.0 μL供試菌液，28℃ 150 r/min培养36 h后，肉眼观察证实无菌生长试管中的最低药物浓度，即为该药物的最小抑菌浓度（MIC）。
1.5 野外药物治疗试验
根据药敏试验结果，选择有较好抑菌效果的盐酸土霉素，按25.0 mg/kg.鱼体重的使用量，均匀地拌和在饲料中制备成药物饵料，对发病池塘养殖的鲫进行投喂，每天投喂1次药饵，连续投喂5 d。
2 结果
2.1 病原菌的分离
从濒死鲫肾脏分离得到细菌1株，暂定名为JY201705。分离菌株在LB平板上形成光滑半透明、圆形、湿润、边缘整齐隆起的灰白色菌落；BHI平板上生长的菌落形与在LB平板类似，但生长速度更快，菌落更大，呈淡黄色。
2.2 病原菌的鉴定
通过革兰氏染色，利用光学显微镜下观察发现菌株JY201705菌株为革兰阴性短杆菌，无芽胞。利用法国梅里埃公司的全自动微生物鉴定系統（型号：VITEK 2 Compact）鉴定的结果为温和气单胞菌（Aeromonas sobria），可信度为98%，鉴定评语为极好的鉴定。具体生化反应见表2。以JY201705菌株的总DNA为模板，经细菌通用引物27F和1 492R扩增到1 506 bp大小的核酸片段，将测序产物进入NCBI网站进行同源性比对，发现其与温和气单胞菌同源性最高，为99%。选用GenBank中已登录的部分气单胞菌属16S rRNA基因序列进行匹配排列，构建系统发育树（图1），结果表明JY201705菌株与A.sobria聚成一枝。因此，综合各方面试验结果，将JY201705菌株鉴定为温和气单胞菌。
2.3 药物敏感性试验
各种抗菌药物对菌株JY201705的MIC测定结果如表3所示。在10种供试药物中，以盐酸四环素、盐酸土霉素和氟苯尼考具有比较好的抑菌效果，最小抑菌浓度分别为0.39、0.78 和1.56 μg/mL， 其他各种药物的抑菌效果比较差。
2.4 野外治疗效果
采用抑菌效果较好的盐酸土霉素对患病鲫进行治疗，在投喂药饵2 d后，鲫死亡率即开始度下降，连续用药5 d后，养殖池塘内鲫基本上停止了死亡，说明盐酸土霉素对该疾病具有很好的治疗效果。
3 讨论
鱼类发生病害以后，为了制定有效的治疗措施，首先要进行病原的确定。本试验中，利用显微镜对寄生虫的进行检查，发现除鳃部有少量车轮虫寄生外，未在其他组织中发现大量的寄生虫，因此排除了寄生虫疾病的可能。据已有的报道，鲫的病毒性疾病主要有2种，一种为鲤痘疮病（Carp pox），其病原为疱疹病毒科的鲤疱疹病毒I型（Cyprinid herpesvirus 1， CyHV-1），该病主要症状是体表出现乳头状突起的增生物，体表无充血症状，通常在冬季和早春低温季节发生[2]，与本病在发生季节和症状上截然不同，因此可以排除鲤痘疮病的可能而未进行相应的检测；另一种为鲤疱疹病毒II型（Cyprinid herpesvirus II， CyHV-II）引起疱疹病毒病，其主要症状为鳃和体表出血，流行温度为20～25 ℃，与本病的特征极为相似，但本试验中利用套式PCR技术未能检测鲤疱疹病毒II型阳性，因此初步排除了病毒性疾病的可能。此外，从患病鲫肾和脾脏组织中分离到大量形态一致的菌落，利用全自动细菌鉴定仪将其鉴定为温和气单胞菌，此外，通过分子生物学的方法进一步验证了其鉴定的可靠性。利用全自动细菌鉴定仪对细菌纯培养物开展鉴定通常只需要4～6 h，较快的鉴定速度非常符合生产实际的要求。根据柯赫氏法则，为了对分离的疑似病原进行确认，应该利用分离株进行回感试验，但感染试验通常要观察14 d以上，生产实践中病害一旦发生，时间极为紧迫，所以本试验中没有开展回感试验；但是，根据鉴定结果，分离到的疑似病原为温和气单胞菌，温和气单胞菌是一种水产动物常见病原，能引起鲫、鲤、鲢、草鱼、团头鲂等淡水鱼类的病害[4， 12-15]。因此，我们将其判断为引起此次病害的病原。
为了使药物在治疗水产动物疾病的过程中获得较好的效果，在决定使用某种药物之前，需要针对病原菌进行药物敏感性测定。只有在分离到病原菌，并测定该病原菌对拟选用药物敏感程度的基础上，才能选择适当的药物和适宜的用药量对疾病进行治疗，不然，就可能导致盲目选用药物，造成治疗效果不佳和药物对养殖水环境的污染。关于菌株对药物敏感性的测定，通常使用的方法有2种，一种为纸片法，将带有某种药物的纸片粘贴于已涂布待测菌液的平板上，培养24～48 h后通过测定抑菌圈的大小判断敏感程度，该方法操作方便，但只能用于定性试验。另一种方法为本试验中使用的MIC法，该方法操作较纸片法繁琐，但能准确计算出具体的MIC值，并可据此估计药物的具体使用浓度，因此在生产实际中较为实用。在本研究中，盐酸土霉素、盐酸四环素和氟苯尼考对菌株JY201705有较好的抑菌效果，这与肖艳翼等[16]的测试结果较为一致，但胡琳琳等[17]，巴翠玉等[18]，徐海圣等[19]利用分别从金鱼、大马哈鱼、黄鳝中分离到的温和气单胞菌开展药物敏感性测定，发现其对四环素耐药。这反应出同种细菌的不同菌株耐药情况存在很大的差别，因此，在用药前，开展药敏试验显得十分重要。本试验中利用盐酸土霉素治疗鲫的病害取得了较好的效果，但是，这并不意味着这种药物就永远是抑制该池塘温和气单胞菌的特效药物，因为病原菌对抗菌药物的敏感程度会发生改变。最近，陈昌福等[20]的研究表明，利用温和气单胞菌在含氟苯尼考的FWA培养基中传代9次以后，氟苯尼考对该菌株的MIC值上升了4～8倍，当停止使用该药物一段时间后，MIC也会随之下降。此外，目前我国的养殖水体大部分是开放型的，耐药性可以在不同菌体间相互传递，由于在同一个水域中从事水产养殖生产的不同养殖业者在预防和治疗同期发生的水产动物病害时，可能选择不同种类的抗生素类药物，这会导致病原菌在短时间内对多种药物产生耐药性。因此，为了避免病原菌过快地对某些抗生素类药物产生耐药性，同一个养殖水域的养殖业者应该共同关注水域中致病菌耐药性的变化趋势，科学合理地选用药物，达到避免或延缓该水域中病原菌产生耐药性。
近年来，鲫疱疹病毒的发生情况十分普遍，很多养殖者通常看到头部发黑、体表出血等症状就认为是疱疹病毒感染，从而失去养殖信心。而本试验的研究表明，在确认为细菌性病原引起的出血症状后，筛选合适的药物进行治疗，能起到较好的效果。此外，也有研究表明，对于鲫疱疹病毒的防控，免疫增强剂的应用具有较好的应用效果[21]。因此，在病害发生后，一定先查找病因，再选择合理的防控策略。
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（收稿日期：2017-09-07）
