探讨食品检验中乳酸菌的鉴定方法

据《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》标准所示，乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）主要有乳杆菌、链球菌以及双歧杆菌三种菌属，并在食品、药品中广泛存在。为响应国家对食品安全的监管，本文特从不同角度鉴定食品中的乳酸菌菌种水平，详细研究过程如下：
资料与方法
一般资料。本次研究所有菌种均采自某市微生物菌种保藏中心，共计15株。其中乳酸杆菌6株，双歧杆菌7株，链球菌2株。
鉴定仪器：（1）API鉴定系统、API 50 CHL板条、API 20A 板条（生产厂家：法國生物梅里埃公司）；（2）RP耗材样品制备包（生产厂家：美国杜邦公司）；（3）生化管（生产厂家：杭州滨和微生物）；（4）Riboprinter全自动微生物基因指纹鉴定系统（生产厂家：美国Dupont公司）；（5）Quantity One紫外成像仪、电泳仪（生产厂家：美国BioRad公司）；（6）Veritii PCR扩增仪（生产厂家：美国ABI公司），体积为50μL[2]。
鉴定试剂：（1）细菌基因组DNA提取试剂盒（生产厂家：北京天根生物）；（2）DNA Marker、PCR缓冲体系（缓冲液5μL，含MgCl2）以及rTaqDNA聚合酶（生产厂家：大连宝生物工程有限公司）0.25μL；（3）正向引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）、反向引物1492R（5-TACGGCTACCTGTTACTT-3）各200pmol/L。
鉴定方法。染色镜检：根据《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》中乳酸菌的生化反应指标，筛选单菌落革兰染色镜检。根据《食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌的鉴定》检验双歧杆菌。
API鉴定：乳酸杆菌由API 50 CHL板条进行鉴定，双歧杆菌由API 20A 板条进行鉴定。
分析法鉴定：（1）16S rRNA基因序列分析法鉴定：由DNA提取试剂盒提取单菌落细菌基因组DNA，100℃热盖，95℃持续变性1min，56℃退火30s，72℃延伸90s，PCR循环共30个；72℃延伸10min；采用1.5%琼脂糖凝胶电泳PCR产物，利用紫外凝胶成像分析仪观察电泳结果，然后通过Clustalw软件对测序结果加以分析，并通过GenBank数据库行BLAST对比。（2）RiboPrinter指纹图谱分析法鉴定：将单菌落悬浮于缓冲液内，并作95℃处理，随即加入裂解液A、B 5μL，然后采用Riboprinter全自动微生物基因指纹鉴定系统进行鉴定。
结果
染色镜检。鉴定结果显示，1株乳酸杆菌和1株链球菌的生化反应不符合《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》标准，但5株乳酸杆菌和1株链球菌的生化反应符合标准。6株双歧杆菌的生化反应不符合标准，仅1例完全符合。如图所示，所有菌株均为革兰阳性菌，无芽孢。
API鉴定。4株乳杆菌鉴定结果显示“类干酪乳杆菌干酪亚种”，未达到“种”水平。2株双歧杆菌鉴定结果显示“内放线菌”，未达到“属”水平；4株双歧杆菌鉴定结果显示“双歧杆菌1”，未达到“种”水平。2株乳杆菌、2株链球菌以及1株双歧杆菌鉴定结果均达到“种”水平。
分析法鉴定。16S rRNA基因序列分析法鉴定：15株中12株鉴定结果达到“种”或“亚种”水平，但3例未达到。RiboPrinter指纹图谱分析法鉴定：15株中11株鉴定结果达到“种”或“亚种”水平，3例未达到，1例未能鉴定。
讨论
《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》指出，菌株不同，其生理生化特征存在明显差异，因此本文结果显示6株双歧杆菌的生化反应不符合标准，且API鉴定结果显示15株中10株仅达到“属”水平。
而分析法鉴定结果相对理想，比如16S rRNA基因序列分析法和RiboPrinter指纹图谱分析法通过PCR对DNA片段加以选择，不受培养条件限制，其鉴定结果如本文所示：15株中11株鉴定结果达到“种”或“亚种”水平。综合以上三种鉴定方法可知，参照《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》与《食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌的鉴定》的染色镜检虽具有一定乳杆菌、链球菌的鉴定能力，但双歧杆菌的鉴定水平不足；而API对三种菌属的鉴定能力基本一致，但整体水平相对较弱，无法达到“种”水平；相较以上两种方法，分析法鉴定既符合国家标准，同时又对API鉴定进行了有效补充。
综上所述，在食品检验中，分析法鉴定水平最高，为食品安全提供有力保障，值得大力推广。