电喷雾质谱结合化学计量学方法快速筛选玛咖促睾丸间质细胞增殖活性成分
孙佳明 田淋淋 何忠梅 孟令文 孙慧 阚俊明 张辉
摘要 应用电喷雾串联质谱法（ESIMS/MS）对云南和秘鲁产玛咖样品中低极性化学成分进行检测，获得各样品的一级质谱指纹谱图和各离子峰的二级质谱数据，并测定各样品促进大鼠睾丸间质细胞增殖活性，采用化学计量学方法主成分分析（PCA）、偏最小二乘法（PLS）和灰色关联度分析（GRA）对所获得的一级质谱数据进行处理后，可有效区分玛咖的不同产地，且筛选出其中具有促大鼠睾丸间质细胞增殖活性的可能成分，进而通过二级质谱数据分析得到可能活性成分的结构。实验结果表明，玛咖低极性成分具有很好的促大鼠睾丸间质细胞增殖活性，其中活性较强的主要为Nbenzylhexadecanamide和Nbenzy（9Z，12Z，15Z）octadecatrienamide。本方法为简单、快速分析中药中促睾丸间质细胞增殖活性成分筛选方法提供了借鉴。
关键词玛咖；不同产地；电喷雾串联质谱；化学计量学方法；促睾丸间质细胞增殖
1引言
玛咖（Lepidiummeyenii）为十字花科Brassicaceae独行菜属Lepidium植物，原产于南美洲安第斯山区[1]。玛咖含有丰富的营养成分和具有多种生物活性的次级代谢产物，其中低极性玛咖酰胺被认为是其特有的标志性成分[2～4]。玛咖具有多方面的药理作用，包括提高生育力和性功能、抗疲劳、抗氧化、缓解更年期综合症、抗衰老和抗肿瘤等作用[3～5]，在保健品和药用方面具有广阔的开发前景[6]。
近年来对玛咖中成分的分析方法主要有酸性染料比色法、薄层色谱法（TLC）、气相色谱质谱联用法（GCMS）、高效液相色谱法（HPLC）和高效液相色谱电喷雾串联质谱法（HPLCESIMS/MS）[7～12＼]。而对于玛咖的玛咖酰胺类成分的研究主要集中在使用酸性染料比色法检测总生物碱含量[9＼]，以及使用高效液相色谱结合标准品对主要玛咖酰胺类化合物的定性与定量研究上[13＼]。电喷雾电离串联质谱技术作为一种软电离技术，已成为研究天然产物结构的重要手段。直接进样电喷雾串联质谱法只需要很少的样品量，并且不需要对被分析物进行分离处理，节省了分析步骤，提高了检测效率[14＼]。如能将其与化学计量学方法结合应用[15＼]，就可将被分析中药等复杂体系中化学成分组成及结构与其对应活性相关联，从而达到快速筛选活性成分的目的。
本研究利用直接进样电喷雾串联质谱法对玛咖低极性化学成分进行分析，结合化学计量学对所获得的电喷雾质谱指纹图谱及不同产地玛咖样品促睾丸间质细胞增殖活性数据进行处理。结果用于对来源于不同产地的玛咖进行有效区分，并快速筛选分析玛咖中具有促大鼠睾丸间质细胞增殖活性的可能成分和结构，为深入研究玛咖中促睾丸间质细胞增殖活性成分提供分析方法基础。
2实验部分
2.1仪器与试剂
质谱分析采用6320iontrap电喷雾离子阱质谱（美国Agilent公司）；KQ3200BE超声波清洗器（中国昆山市超声仪有限公司）；Model680型酶标仪（日本TAKARA公司）；TGL16B台式离心机（中国上海安亭科学仪器有限公司）；BP211D型十万分之一电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）。
玛咖经长春中医药大学张辉教授鉴定为十字花科独行菜属植物玛咖（Lepidiummeyenii）的干燥根及根茎。不同批号的云南产玛咖（Y01Y04）和秘鲁产玛咖（M01M06）购于长春北京同仁堂药店；乙腈、甲醇和甲酸（色谱纯，美国Fisher公司）；水为超纯水（美国MilliQ纯水仪）；四甲基偶氮唑盐（MTT，美国Amresco公司）；DMEM（美国Gibco公司）。
2.2样品制备
取玛咖干燥根及根茎适量粉碎为20目粗粉，称取粉末1.0g，加入无水乙醚10mL，在50℃以下超声提取60min，过滤，滤液40℃减压回收溶剂至干，残渣用乙腈溶解并定容至1mL，用0.22μm滤膜过滤，滤液用于电喷雾质谱分析。
另称取粉末1.0g，按上法制备得到乙醚提取物，溶于适量含有0.5%DMSO的DMEM溶液，配制成100μg/mL玛咖乙醚提取物样品溶液，用于睾丸间质细胞增殖实验。
2.3质谱条件
质量范围m/z300～500，实验前质量数经过校正；目标分子量400；实验中采用正离子模式。样品通过流动注射泵进样，流速5μL/min；干燥气温度：350℃；干燥气流量：9mL/min；雾化气压强：0.24MPa（35.0psi）；毛细管电压：3.5kV。
2.4睾丸间质细胞的分离培养
取3只SD雄性成年大鼠（吉林大学动物中心提供〔动物合格证号：SCXK（吉）20130005〕），体重250～300g。大鼠断颈处死，剖开腹腔剥离取出睾丸，放入TypeI胶原酶中，37℃恒温振荡器中振荡消化15min，用3倍体积DMEM稀释终止消化。过滤、离心后制成悬浮液，吸出后接种于培养瓶中，放于37℃CO2孵箱中培养[16＼]。
2.5应用MTT方法检测玛咖对细胞增殖状况
睾丸间质细胞分为实验组和对照组，将细胞接种于96孔培养板，每孔100μL细胞悬液，每组设立3个平行孔，48h后弃去培养液。实验组加入100μL的玛咖乙醚提取物样品溶液；对照组加入等体积含有0.5%DMSO的DMEM溶液，继续培养24h，然后每孔加入5mg/mLMTT溶液20μL，继续孵育4h，弃上清，每孔加DMSO100μL，充分振荡10min，在波长570nm处，用酶标仪测定光密度值。
3结果与讨论
3.1不同产地玛咖中化学成分的电喷雾质谱分析
采用正离子扫描模式，在优化的ESIMS条件下对来源于云南和秘鲁的玛咖样品进行质谱分析，得到其一级质谱指纹谱图（图1）。从图1可知，两种样品均在m/z300～500范围内具有丰富的物质信息，表明ESIMS能够检测玛咖多种低极性化学成分。观测这些质谱峰信号后可以发现两种产地玛咖樣品所含化学成分极为相似，以质荷比为偶数的质谱峰为主，包括m/z346，360，368，370，384，406，408，422，436，438等质谱信号，其中以m/z384，406，408，422的丰度最大，说明两种样品中富含较多的生物碱类成分，并且m/z384，406，408，422对应的4个成分含量较大。但同时两种样品也存在着一些明显的差别，如两种样品中含有很少质荷比为奇数的质谱峰中，云南产玛咖含有的m/z307质谱峰丰度最高，略低于质荷比为偶数的m/z384，408，422的质谱峰，而秘鲁产玛咖含有的m/z321，333质谱峰丰度明显高于所有质荷比为偶数的质谱峰。为了更好地区分玛咖由于产地不同造成的代表性化学成分玛咖酰胺组成的差异，本研究采用主成分分析法重点针对质荷比为偶数的质谱信号进行统计学处理。
3.2不同产地玛咖电喷雾质谱指纹图谱的主成分分析
主成分分析法（PCA）是利用降维的思想，在损失很少信息的前提下把多个指标转化为几个综合指标的化学计量学方法。在研究复杂问题时只考虑少数几个主成分，更容易抓住主要矛盾，揭示复杂体系内部变量之间规律，使问题得到简化，提高分析效率[17，18＼]。本研究采集了两种产地共10个玛咖样品的电喷雾质谱以及质谱指纹图谱数据，通过PCA来实现不同产地来源样品的快速区分，从而为玛咖产地的快速鉴别提供一种快捷方法。
将每个样品质谱数据m/z300～500范围内的质谱峰丰度作为变量，应用SIMCAP11对每个导出的一级质谱数据进行PCA分析，自动得到所有样本的PCA得分图和载荷图。得分图用于区分样本，载荷图用于分析变量对样本分类所起的作用，所得主成分分析的结果见图2。
如图2A所示，PC1和PC2两个主成分分别代表了93.8%和3.3%的样品变量信息，二者之和达到了97.1%，说明包含了原始样本的绝大部分信息。图2A为二维的PCA得分图，图中每个点代表1个样本，其中Y代表云南产玛咖，M代表秘鲁产玛咖，可以看出两个产地的玛咖明显分为两类，JP得到良好区分，表明两种产地的玛咖存在差异。图2B为二维的PCA载荷图，图中每个点代表1个离子峰，其绝对值在载荷图中得分越高，代表该峰对样品分类所起的作用越大。所有离子峰均在第一主成分上呈正相关，并且与云南产玛咖样品所在区域相对应，说明这些化合物对云南产玛咖样品的分类起重要作用[19＼]；尤其是m/z346系数的绝对值最大，对样本分类所起的贡献度也较大，可以将其作为特征差异峰。
3.3不同产地玛咖电喷雾质谱指纹图谱与促睾丸间质细胞增殖的灰色关联度分析
通过主成分分析得到了区分两种产地玛咖电喷雾质谱指纹图谱中的特征差异峰，但是未能探明特征差异峰对应成分与玛咖活性是否相关。故本研究选择体外大鼠睾丸间质细胞增殖率作为活性指标，对其提高生育力和性功能活性进行表征，进而应用灰色关联度分析，以期筛选出玛咖提高生育力和性功能的活性成分。
不同产地玛样品在浓度为100μg/mL时均具有促进大鼠睾丸间质细胞增殖作用，结果见表1。
3.4不同产地玛咖电喷雾质谱指纹图谱与促睾丸间质细胞增殖的灰色关联度分析
主成分分析结果表明，得分贡献度较大的质谱峰质荷比基本为偶数，且玛咖的特征成分玛咖酰胺为含奇数个N的生物碱类成分，其质荷比均为偶数。故本研究将不同产地玛咖的电喷雾质谱一级质谱中CM（44质荷比为偶数的共有离子峰丰度数据与促睾丸间质细胞增殖活性数据进行关联，以期筛选出与促睾丸CM）
间质细胞增殖活性密切相关到玛咖酰胺。灰色关联分析的目的是确定参考序列和若干个比较序列之间的关联系数和关联度，寻求系统中各个因素间的主要关系。且灰色关联分析方法不要求有大量数据，适合于少数据、贫信息的情况，这正符合中药与天然药物活性成分筛选的实际需要。通过对原始数据标准化转化后，计算灰色关联度[20＼]，得到离子峰對睾丸间质细胞增殖活性的贡献程度排名为：m/z346>384>424>422>368>410>406>436>370>360>408>438>330。其中有5个共有离子峰所代表的化学成分与促睾丸间质细胞增殖活性的关联度>0.6，但与其它离子峰的关联度差别不明显，由此可知，玛咖促睾丸间质细胞增殖活性是多种玛咖酰胺类成分共同作用的结果（表2）。
3.5不同产地玛咖电喷雾质谱指纹图谱与促睾丸间质ZH（细胞增殖的偏最小二乘法分析
利用SIMCAP11软件，经过多次提取主成分，多次迭代，拟合出不同产地玛咖的电喷雾质谱一级质谱中质荷比为偶数的共有离子峰丰度数据与促睾丸间质细胞增殖活性数据之间的数理方程[21＼]：y=
0262083x330+0528701x346-0369171x360+0399358x368+0388541x370+0209021x384-0105789x406+00514652x408+00271077x410-0443981x422-0391626x424-0195177x436-0.156797x438（x330～x438为共有离子峰丰度，y为不同产地玛咖促睾丸间质细胞增殖活性），各离子峰所代表的化学成分对促睾丸间质细胞增殖活性贡献大小顺序为：m/z346>422>368>424>370>360>330>384>436>438>406>408>410，其中m/z346，368，370，384，408和410与活性呈正相关，而m/z330，360，406，422，424，436和438与活性呈负相关。ZH）
3.6促睾丸间质细胞增殖活性成分结构分析
综合灰色关联度分析和偏最小二乘法分析结果，可以发现对促睾丸间质细胞增殖活性贡献最大的前5位离子峰有4个是重合的，分别是m/z346，368，422和424。而且，其中m/z346和m/z368与活性呈正相关，因此重点对这两个离子峰所代表的化学成分的结构进行分析。为了明确它们的可能结构，将m/z346和m/z368进行二级质谱分析，所得结果及可能结构式和质谱裂解方式分别见图3和图4。
根据二级质谱结果推测，m/z346为准分子离子峰＼[M+H＼]+，说明其分子量为345；在碰撞诱导解离过程中，m/z346离子失去一分子苯甲胺（107Da）生成m/z239离子；m/z346离子失去一分子hexadec1en1one（238Da）生成m/z108离子；m/z346离子失去一分子苯（78Da）生成m/z268离子；m/z346离子失去一分子Nmethylenepalmitamide（210Da）生成m/z136离子。以上数据与文献＼[7，8，11，13，22＼]报道一致，故确认EIC为m/z346的化合物为Nbenzylhexadecanamide。
准分子离子峰＼[M+H＼]+（m/z368），说明其分子量为367；在碰撞诱导解离过程中，m/z368离子失去一分子苯甲胺（107Da）生成m/z261离子；m/z368离子失去一分子9，12，15顺式三烯十八烷酮（260Da）生成m/z108离子；m/z368离子失去一分子（4Z，7Z）deca1，4，7triene（136Da）生成m/z232离子；m/z368离子失去一分子（Z）hepta1，4diene（96Da）生成m/z272离子；m/z368离子失去一分子丁烯（56Da）生成m/z312离子；m/z368离子失去一分子苯甲胺（107Da）生成m/z261离子。以上数据与文献＼[8，11，13，22＼]报道一致，故确认EIC为m/z368的化合物为Nbenzy（9Z，12Z，15Z）octadecatrienamide。
4结论
利用ESIMS对不同产地玛咖样品进行质谱分析，获得其一级质谱指纹谱图，结合主成分分析法（PCA）对所获得的指纹图谱数据进行处理，能够较好地区分云南产和秘鲁产的玛咖样品，从而为玛咖产地的快速鉴别提供一种快捷方法。应用偏最小二乘法（PLS）和灰色关联度分析（GRA）对所获得的一级质谱数据进行处理，快速筛选出具有促大鼠睾丸间质细胞增殖活性的可能成分。结合二级质谱数据分析得到2个可能活性成分的结构为Nbenzylhexadecanamide和Nbenzy（9Z，12Z，15Z）octadecatrienamide。值得注意的是，通过PCA分析得到的不同产地玛咖特征差异峰与通过PLS、GRA分析得到的最佳促睾丸间质细胞增殖活性成分均是m/z346（Nbenzylhexadecanamide），且文献报道Nbenzylhexadecanamide具有延长小鼠负重游泳时间、增强小鼠抗疲劳作用[23＼]，因此可以将其作为玛咖质量控制的重要指标性成分。但本研究推测出的活性成分仅为排序在前列的具有对活性正向影响的较少化合物，其它排序靠后以及负向影响的化合物的结构还未能确定，尚需进一步研究。
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AbstractThelowpolarityconstituentsfromLepidiummeyeniiinYunnanandPeruweredetectedbyelectrosprayionizationtandemmassspectrometry（ESIMS/MS）.Theeffectsof10samplesofLepidiummeyeniionproliferationofratleydigcellsweremeasured.AftertheprocessofMSdatausingprincipalcomponentanalysis（PCA）methods，thesamplesfromYunnanandPeruweredistinguishedeffectively.Subsequently，thegreyrelationaldegreeanalysis（GRA）andpartialleastsquaresanalysis（PLS）wereemployedtorevealthecorrelationbetweencommonpeaksofESIfingerprintofLepidiummeyeniifromdifferentgeographicaloriginsandproliferationactivityofratleydigcells.TheresultssuggestedthatmostlowpolarityconstituentsfromLepidiummeyeniihadgoodactivitiesonproliferationofratleydigcells，inwhichNbenzylhexadecanamideandNbenzy（9Z，12Z，15Z）octadecatrienamideexhibitedthehighestactivities.Inaddition，theproposedprocedurecouldalsobeusedasasimple，quickreferencemethodtoscreentheactivecomponentspromotingLeydigcellproliferationintraditionalChinesemedicine.
KeywordsLepidiummeyenii；Differentgeographicalorigin；Electrosprayionizationtandemmassspectrometry；Chemometricsmethod；Promotingleydigcellproliferation
HQWT6JY（Received26March2016；accepted12July2016）
ThisworkwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina（No.31570347）.
摘要 应用电喷雾串联质谱法（ESIMS/MS）对云南和秘鲁产玛咖样品中低极性化学成分进行检测，获得各样品的一级质谱指纹谱图和各离子峰的二级质谱数据，并测定各样品促进大鼠睾丸间质细胞增殖活性，采用化学计量学方法主成分分析（PCA）、偏最小二乘法（PLS）和灰色关联度分析（GRA）对所获得的一级质谱数据进行处理后，可有效区分玛咖的不同产地，且筛选出其中具有促大鼠睾丸间质细胞增殖活性的可能成分，进而通过二级质谱数据分析得到可能活性成分的结构。实验结果表明，玛咖低极性成分具有很好的促大鼠睾丸间质细胞增殖活性，其中活性较强的主要为Nbenzylhexadecanamide和Nbenzy（9Z，12Z，15Z）octadecatrienamide。本方法为简单、快速分析中药中促睾丸间质细胞增殖活性成分筛选方法提供了借鉴。
关键词玛咖；不同产地；电喷雾串联质谱；化学计量学方法；促睾丸间质细胞增殖
1引言
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近年来对玛咖中成分的分析方法主要有酸性染料比色法、薄层色谱法（TLC）、气相色谱质谱联用法（GCMS）、高效液相色谱法（HPLC）和高效液相色谱电喷雾串联质谱法（HPLCESIMS/MS）[7～12＼]。而对于玛咖的玛咖酰胺类成分的研究主要集中在使用酸性染料比色法检测总生物碱含量[9＼]，以及使用高效液相色谱结合标准品对主要玛咖酰胺类化合物的定性与定量研究上[13＼]。电喷雾电离串联质谱技术作为一种软电离技术，已成为研究天然产物结构的重要手段。直接进样电喷雾串联质谱法只需要很少的样品量，并且不需要对被分析物进行分离处理，节省了分析步骤，提高了检测效率[14＼]。如能将其与化学计量学方法结合应用[15＼]，就可将被分析中药等复杂体系中化学成分组成及结构与其对应活性相关联，从而达到快速筛选活性成分的目的。
本研究利用直接进样电喷雾串联质谱法对玛咖低极性化学成分进行分析，结合化学计量学对所获得的电喷雾质谱指纹图谱及不同产地玛咖样品促睾丸间质细胞增殖活性数据进行处理。结果用于对来源于不同产地的玛咖进行有效区分，并快速筛选分析玛咖中具有促大鼠睾丸间质细胞增殖活性的可能成分和结构，为深入研究玛咖中促睾丸间质细胞增殖活性成分提供分析方法基础。
2实验部分
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质谱分析采用6320iontrap电喷雾离子阱质谱（美国Agilent公司）；KQ3200BE超声波清洗器（中国昆山市超声仪有限公司）；Model680型酶标仪（日本TAKARA公司）；TGL16B台式离心机（中国上海安亭科学仪器有限公司）；BP211D型十万分之一电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）。
玛咖经长春中医药大学张辉教授鉴定为十字花科独行菜属植物玛咖（Lepidiummeyenii）的干燥根及根茎。不同批号的云南产玛咖（Y01Y04）和秘鲁产玛咖（M01M06）购于长春北京同仁堂药店；乙腈、甲醇和甲酸（色谱纯，美国Fisher公司）；水为超纯水（美国MilliQ纯水仪）；四甲基偶氮唑盐（MTT，美国Amresco公司）；DMEM（美国Gibco公司）。
2.2样品制备
取玛咖干燥根及根茎适量粉碎为20目粗粉，称取粉末1.0g，加入无水乙醚10mL，在50℃以下超声提取60min，过滤，滤液40℃减压回收溶剂至干，残渣用乙腈溶解并定容至1mL，用0.22μm滤膜过滤，滤液用于电喷雾质谱分析。
另称取粉末1.0g，按上法制备得到乙醚提取物，溶于适量含有0.5%DMSO的DMEM溶液，配制成100μg/mL玛咖乙醚提取物样品溶液，用于睾丸间质细胞增殖实验。
2.3质谱条件
质量范围m/z300～500，实验前质量数经过校正；目标分子量400；实验中采用正离子模式。样品通过流动注射泵进样，流速5μL/min；干燥气温度：350℃；干燥气流量：9mL/min；雾化气压强：0.24MPa（35.0psi）；毛细管电压：3.5kV。
2.4睾丸间质细胞的分离培养
取3只SD雄性成年大鼠（吉林大学动物中心提供〔动物合格证号：SCXK（吉）20130005〕），体重250～300g。大鼠断颈处死，剖开腹腔剥离取出睾丸，放入TypeI胶原酶中，37℃恒温振荡器中振荡消化15min，用3倍体积DMEM稀释终止消化。过滤、离心后制成悬浮液，吸出后接种于培养瓶中，放于37℃CO2孵箱中培养[16＼]。
2.5应用MTT方法检测玛咖对细胞增殖状况
睾丸间质细胞分为实验组和对照组，将细胞接种于96孔培养板，每孔100μL细胞悬液，每组设立3个平行孔，48h后弃去培养液。实验组加入100μL的玛咖乙醚提取物样品溶液；对照组加入等体积含有0.5%DMSO的DMEM溶液，继续培养24h，然后每孔加入5mg/mLMTT溶液20μL，继续孵育4h，弃上清，每孔加DMSO100μL，充分振荡10min，在波长570nm处，用酶标仪测定光密度值。
3结果与讨论
3.1不同产地玛咖中化学成分的电喷雾质谱分析
采用正离子扫描模式，在优化的ESIMS条件下对来源于云南和秘鲁的玛咖样品进行质谱分析，得到其一级质谱指纹谱图（图1）。从图1可知，两种样品均在m/z300～500范围内具有丰富的物质信息，表明ESIMS能够检测玛咖多种低极性化学成分。观测这些质谱峰信号后可以发现两种产地玛咖樣品所含化学成分极为相似，以质荷比为偶数的质谱峰为主，包括m/z346，360，368，370，384，406，408，422，436，438等质谱信号，其中以m/z384，406，408，422的丰度最大，说明两种样品中富含较多的生物碱类成分，并且m/z384，406，408，422对应的4个成分含量较大。但同时两种样品也存在着一些明显的差别，如两种样品中含有很少质荷比为奇数的质谱峰中，云南产玛咖含有的m/z307质谱峰丰度最高，略低于质荷比为偶数的m/z384，408，422的质谱峰，而秘鲁产玛咖含有的m/z321，333质谱峰丰度明显高于所有质荷比为偶数的质谱峰。为了更好地区分玛咖由于产地不同造成的代表性化学成分玛咖酰胺组成的差异，本研究采用主成分分析法重点针对质荷比为偶数的质谱信号进行统计学处理。
3.2不同产地玛咖电喷雾质谱指纹图谱的主成分分析
主成分分析法（PCA）是利用降维的思想，在损失很少信息的前提下把多个指标转化为几个综合指标的化学计量学方法。在研究复杂问题时只考虑少数几个主成分，更容易抓住主要矛盾，揭示复杂体系内部变量之间规律，使问题得到简化，提高分析效率[17，18＼]。本研究采集了两种产地共10个玛咖样品的电喷雾质谱以及质谱指纹图谱数据，通过PCA来实现不同产地来源样品的快速区分，从而为玛咖产地的快速鉴别提供一种快捷方法。
将每个样品质谱数据m/z300～500范围内的质谱峰丰度作为变量，应用SIMCAP11对每个导出的一级质谱数据进行PCA分析，自动得到所有样本的PCA得分图和载荷图。得分图用于区分样本，载荷图用于分析变量对样本分类所起的作用，所得主成分分析的结果见图2。
如图2A所示，PC1和PC2两个主成分分别代表了93.8%和3.3%的样品变量信息，二者之和达到了97.1%，说明包含了原始样本的绝大部分信息。图2A为二维的PCA得分图，图中每个点代表1个样本，其中Y代表云南产玛咖，M代表秘鲁产玛咖，可以看出两个产地的玛咖明显分为两类，JP得到良好区分，表明两种产地的玛咖存在差异。图2B为二维的PCA载荷图，图中每个点代表1个离子峰，其绝对值在载荷图中得分越高，代表该峰对样品分类所起的作用越大。所有离子峰均在第一主成分上呈正相关，并且与云南产玛咖样品所在区域相对应，说明这些化合物对云南产玛咖样品的分类起重要作用[19＼]；尤其是m/z346系数的绝对值最大，对样本分类所起的贡献度也较大，可以将其作为特征差异峰。
3.3不同产地玛咖电喷雾质谱指纹图谱与促睾丸间质细胞增殖的灰色关联度分析
通过主成分分析得到了区分两种产地玛咖电喷雾质谱指纹图谱中的特征差异峰，但是未能探明特征差异峰对应成分与玛咖活性是否相关。故本研究选择体外大鼠睾丸间质细胞增殖率作为活性指标，对其提高生育力和性功能活性进行表征，进而应用灰色关联度分析，以期筛选出玛咖提高生育力和性功能的活性成分。
不同产地玛样品在浓度为100μg/mL时均具有促进大鼠睾丸间质细胞增殖作用，结果见表1。
3.4不同产地玛咖电喷雾质谱指纹图谱与促睾丸间质细胞增殖的灰色关联度分析
主成分分析结果表明，得分贡献度较大的质谱峰质荷比基本为偶数，且玛咖的特征成分玛咖酰胺为含奇数个N的生物碱类成分，其质荷比均为偶数。故本研究将不同产地玛咖的电喷雾质谱一级质谱中CM（44质荷比为偶数的共有离子峰丰度数据与促睾丸间质细胞增殖活性数据进行关联，以期筛选出与促睾丸CM）
间质细胞增殖活性密切相关到玛咖酰胺。灰色关联分析的目的是确定参考序列和若干个比较序列之间的关联系数和关联度，寻求系统中各个因素间的主要关系。且灰色关联分析方法不要求有大量数据，适合于少数据、贫信息的情况，这正符合中药与天然药物活性成分筛选的实际需要。通过对原始数据标准化转化后，计算灰色关联度[20＼]，得到离子峰對睾丸间质细胞增殖活性的贡献程度排名为：m/z346>384>424>422>368>410>406>436>370>360>408>438>330。其中有5个共有离子峰所代表的化学成分与促睾丸间质细胞增殖活性的关联度>0.6，但与其它离子峰的关联度差别不明显，由此可知，玛咖促睾丸间质细胞增殖活性是多种玛咖酰胺类成分共同作用的结果（表2）。
3.5不同产地玛咖电喷雾质谱指纹图谱与促睾丸间质ZH（细胞增殖的偏最小二乘法分析
利用SIMCAP11软件，经过多次提取主成分，多次迭代，拟合出不同产地玛咖的电喷雾质谱一级质谱中质荷比为偶数的共有离子峰丰度数据与促睾丸间质细胞增殖活性数据之间的数理方程[21＼]：y=
0262083x330+0528701x346-0369171x360+0399358x368+0388541x370+0209021x384-0105789x406+00514652x408+00271077x410-0443981x422-0391626x424-0195177x436-0.156797x438（x330～x438为共有离子峰丰度，y为不同产地玛咖促睾丸间质细胞增殖活性），各离子峰所代表的化学成分对促睾丸间质细胞增殖活性贡献大小顺序为：m/z346>422>368>424>370>360>330>384>436>438>406>408>410，其中m/z346，368，370，384，408和410与活性呈正相关，而m/z330，360，406，422，424，436和438与活性呈负相关。ZH）
3.6促睾丸间质细胞增殖活性成分结构分析
综合灰色关联度分析和偏最小二乘法分析结果，可以发现对促睾丸间质细胞增殖活性贡献最大的前5位离子峰有4个是重合的，分别是m/z346，368，422和424。而且，其中m/z346和m/z368与活性呈正相关，因此重点对这两个离子峰所代表的化学成分的结构进行分析。为了明确它们的可能结构，将m/z346和m/z368进行二级质谱分析，所得结果及可能结构式和质谱裂解方式分别见图3和图4。
根据二级质谱结果推测，m/z346为准分子离子峰＼[M+H＼]+，说明其分子量为345；在碰撞诱导解离过程中，m/z346离子失去一分子苯甲胺（107Da）生成m/z239离子；m/z346离子失去一分子hexadec1en1one（238Da）生成m/z108离子；m/z346离子失去一分子苯（78Da）生成m/z268离子；m/z346离子失去一分子Nmethylenepalmitamide（210Da）生成m/z136离子。以上数据与文献＼[7，8，11，13，22＼]报道一致，故确认EIC为m/z346的化合物为Nbenzylhexadecanamide。
准分子离子峰＼[M+H＼]+（m/z368），说明其分子量为367；在碰撞诱导解离过程中，m/z368离子失去一分子苯甲胺（107Da）生成m/z261离子；m/z368离子失去一分子9，12，15顺式三烯十八烷酮（260Da）生成m/z108离子；m/z368离子失去一分子（4Z，7Z）deca1，4，7triene（136Da）生成m/z232离子；m/z368离子失去一分子（Z）hepta1，4diene（96Da）生成m/z272离子；m/z368离子失去一分子丁烯（56Da）生成m/z312离子；m/z368离子失去一分子苯甲胺（107Da）生成m/z261离子。以上数据与文献＼[8，11，13，22＼]报道一致，故确认EIC为m/z368的化合物为Nbenzy（9Z，12Z，15Z）octadecatrienamide。
4结论
利用ESIMS对不同产地玛咖样品进行质谱分析，获得其一级质谱指纹谱图，结合主成分分析法（PCA）对所获得的指纹图谱数据进行处理，能够较好地区分云南产和秘鲁产的玛咖样品，从而为玛咖产地的快速鉴别提供一种快捷方法。应用偏最小二乘法（PLS）和灰色关联度分析（GRA）对所获得的一级质谱数据进行处理，快速筛选出具有促大鼠睾丸间质细胞增殖活性的可能成分。结合二级质谱数据分析得到2个可能活性成分的结构为Nbenzylhexadecanamide和Nbenzy（9Z，12Z，15Z）octadecatrienamide。值得注意的是，通过PCA分析得到的不同产地玛咖特征差异峰与通过PLS、GRA分析得到的最佳促睾丸间质细胞增殖活性成分均是m/z346（Nbenzylhexadecanamide），且文献报道Nbenzylhexadecanamide具有延长小鼠负重游泳时间、增强小鼠抗疲劳作用[23＼]，因此可以将其作为玛咖质量控制的重要指标性成分。但本研究推测出的活性成分仅为排序在前列的具有对活性正向影响的较少化合物，其它排序靠后以及负向影响的化合物的结构还未能确定，尚需进一步研究。
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AbstractThelowpolarityconstituentsfromLepidiummeyeniiinYunnanandPeruweredetectedbyelectrosprayionizationtandemmassspectrometry（ESIMS/MS）.Theeffectsof10samplesofLepidiummeyeniionproliferationofratleydigcellsweremeasured.AftertheprocessofMSdatausingprincipalcomponentanalysis（PCA）methods，thesamplesfromYunnanandPeruweredistinguishedeffectively.Subsequently，thegreyrelationaldegreeanalysis（GRA）andpartialleastsquaresanalysis（PLS）wereemployedtorevealthecorrelationbetweencommonpeaksofESIfingerprintofLepidiummeyeniifromdifferentgeographicaloriginsandproliferationactivityofratleydigcells.TheresultssuggestedthatmostlowpolarityconstituentsfromLepidiummeyeniihadgoodactivitiesonproliferationofratleydigcells，inwhichNbenzylhexadecanamideandNbenzy（9Z，12Z，15Z）octadecatrienamideexhibitedthehighestactivities.Inaddition，theproposedprocedurecouldalsobeusedasasimple，quickreferencemethodtoscreentheactivecomponentspromotingLeydigcellproliferationintraditionalChinesemedicine.
KeywordsLepidiummeyenii；Differentgeographicalorigin；Electrosprayionizationtandemmassspectrometry；Chemometricsmethod；Promotingleydigcellproliferation
HQWT6JY（Received26March2016；accepted12July2016）
ThisworkwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina（No.31570347）.
