超高效液相色谱—谱联用技术同时检测大鼠血浆中蒿甲醚及其主要代谢产物双氢青蒿素
李春等
摘 要 为了研究蒿甲醚在大鼠体内的药代动力学行为，应用液液萃取超高效液相色谱单四极杆静电场轨道阱串联质谱技术，建立了高灵敏度的大鼠血浆中蒿甲醚及其主要代谢产物双氢青蒿素的分析方法。以青蒿素为内标（Internal standard，I.S.），在正离子TargetedMS2检测模式下对蒿甲醚和双氢青蒿素进行定性和定量分析。检测离子对分别为m/z 316.2115/163.1117（蒿甲醚）、m/z 302.1958/163.1117（双氢青蒿素）和m/z 300.1803/209.1536（I.S.）；蒿甲醚和双氢青蒿素在2～200 μg/L范围内线性关系良好（R2>0.9990）；检出限为0.8 μg/L；定量限为2.0 μg/L；加标回收率分别为93.7%～103.7%和97.4%～104.7%；相对标准偏差均小于9%。本方法快速灵敏，重现性好，可用于蒿甲醚体内药代动力学研究。
关键词 蒿甲醚； 双氢青蒿素； 静电场轨道阱； 大鼠血浆； 药代动力学
1 引 言
疟疾是由疟原虫引起的可由雌性按蚊传染到人类的重大传染病，多发于非洲、南美等热带欠发达地区，严重威胁着人类的健康。在全球范围内，每年约五十亿人感染疟疾，其中一百多万人死于疟疾[1]。
蒿甲醚（Artemether，ARM）是天然产物青蒿素（Artemisinin，ART）的一种半合成衍生物，因具有比青蒿素更好的生物利用度而广泛用于临床疟疾治疗，蒿甲醚和青蒿素在体内代谢，迅速转化为双氢青蒿素（Dihydroartimisinin， DHA），DHA也具有抗疟活性[2]。为了研究蒿甲醚在模型动物体内的药代动力学，需要同时检测模型动物血浆中蒿甲醚和双氢青蒿素的浓度，建立特异性强、灵敏度高的分析方法。
目前，检测蒿甲醚的方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱质谱联用法和液相色谱质谱联用法。由于青蒿素衍生物分子中没有共轭结构，紫外吸收不明显，因此高效液相色谱法用紫外检测器时需要繁杂的柱后衍生过程才能达到体内药物含量检测所需的灵敏度[3，4]。应用电化学检测器可提高灵敏度，但是需要控制严格的厌氧环境，样品和流动相也都需要脱氧[5，6]。气相色谱质谱联用法可获得高效液相色谱法应用电化学检测器时的检测限，但是需要0.5～1.0 mL的血浆样品[7，8]。液相色谱质谱联用法因其特异性强、灵敏度高、样品无需衍生化处理等优点，近年来被广泛用于青蒿素衍生物的检测。其中高效液相色谱三重四级杆串联质谱技术应用最为广泛[2，9～17]。
静电场轨道阱是一种新兴的一种质谱质量分析器，具有较高的分辨率和质量准确度[18]，具备一级和二级高分辨质谱扫描模式，适用于复杂基质中代谢物的定性与定量分析[19]。目前，应用高效HPLC四级杆静电场轨道阱质谱联用技术做定量分析的报道较少，针对蒿甲醚及其代谢产物测定尚未见报道。本研究建立了超高效液相色谱四级杆静电场轨道阱质谱同时检测蒿甲醚及其主要代谢产物双氢青蒿素的方法。本方法简单快速，特异性强，回收率高，重现性好，并用于蒿甲醚在大鼠体内的药代动力学研究。
2 实验部分
2.1 仪器、材料与试剂
Q Exactive四级杆静电场轨道阱高分辨质谱系统、Dionex UltiMate 3000快速高效液相色谱系统、D11931超纯水系统（美国Thermo Fisher公司）；3K15型高速离心机（德国 Sigma 公司）；MS3型涡旋混合器（德国 IKA 公司）；XA105电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；EWHL388型超低温冰箱（中科美菱低温科技有限责任公司）。
甲醇、乙腈和乙酸乙酯（色谱纯，美国Sigma Aldrich公司）；乙酸铵（迪马科技有限公司）蒿甲醚（ARM）、双氢青蒿素（DHA）和青蒿素（ART）均购自于重庆华立武陵山制药有限公司；清洁级Wistar 大鼠（雄性，体重约200 g）购自北京海淀兴隆实验动物有限公司。
2.2 样品前处理
2.2.1 标准储备液和标准工作液的配制 准确称取ARM和DHA各5.00 mg，用甲醇分别定容至50 mL，配成100 mg/L的ARM储备液和DHA储备液，吸取ARM储备液和DHA储备液各1 mL，用甲醇定容至10 mL，得到ARM和DHA浓度均为10 mg/L的混合储备液。将混合储备液用甲醇逐级稀释成ARM和DHA浓度各为2000， 1000， 500， 200， 100， 50 和20 μg/L的系列工作液。将工作液分别再用大鼠空白血浆稀释10倍，即成ARM和DHA的浓度为200， 100， 50， 20， 10， 5和2 μg/L的标准工作液。将混合储备液，用大鼠空白血浆逐级稀释成180， 90和6 μg/L的标准质量控制工作液。
准确称取ART 5.00 mg，用甲醇定容至50 mL，配成100 mg/L的内标储备液，将此储备液用甲醇稀释为500 μg/L内标工作液。
4 结 论
本研究以超高效液相色谱四级杆静电场轨道阱质谱串联技术建立了大鼠血浆中ARM和DHA同时测定的分析方法，在TargetedMS2模式下，可以实现对ARM和DHA准确的定性和定量分析。本方法特异性强、灵敏度高、准确度好、需要样品量少、单个样品分析时间短，适用于生物基质中ARM及其代谢产物DHA的同时分析检测，为蒿甲醚的药代动力学研究提供技术参考。
References
1 Cobo F. Imported Infectious Deseases. Woodhead Publishing， 2014： 61-90
2 Hilhorst M J， Hendriks G， de Vries R， Hillewaert V， Verhaege T， van de Merbel N C. J. Chromatogr. B， 2014， 965： 45-53
3 Thomas C G， Ward S A， Edwards G. J. Chromatogr.， 1992， 583（1）： 131-136
4 César Ida C， Andrade Nogueira F H， Antnio Pianetti G. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2008， 48（3）： 951-954
5 Sandrenan N， Sioufi A， Godbillon J， Netter C， Donker M， van Valkenburg C. J. Chromatogr. B， 1997， 691（1）： 145-153
6 Karbwang J， NaBangchang K， Molunto P， Banmairuroi V， Congpuong K. J. Chromatogr. B， 1997， 690（12）： 259-265
7 Mohamed S S， Khalid S A， Ward S A， Wan T S， Tang H P， Zheng M， Haynes R K， Edwards G. J. Chromatogr. B， 1999， 731（2）： 251-260
8 Mithwani S， Aarons L， Kokwaro G O， Majid O， Muchohi S， Edwards G， Mohamed S， Marsh K， Watkins W. Br. J. Clin. Pharmacol.， 2003， 57（2）： 146-152
9 Souppart C， Gauducheau N， Sandrenan N， Richard F. J. Chromatogr. B， 2002， 774（2）： 195-203
10 Shi B， Yu Y Q， Li Z D， Zhang L， Zhong Y， Su S M， Liang S P. Chromatographia， 2006， 64（910）： 523-530
11 Hanpithakpong W， Kamanikom B， Singhasivanon P， White N J， Day N P， Lindegardh N. Bioanalysis， 2009， 1（1）： 37-46
12 Huang L， Jayewardene A L， Li X， Marzan F， Lizak P S， Aweeka F T. J. Pharm. Biomed . Anal.， 2009， 50（5）： 959-965
13 Raghunadha R S， Divi K R， Chandiran I S， Jayaveera K N. Journal of Pharmacy Research， 2010， 3（8）： 1943-1946
14 Magalhes I R， Jabor V A， Faria A M， Collins C H， Jardim I C， Bonato P S. Talanta， 2010， 81（3）： 941-947
15 Wiesner L， Govender K， Meredith S A， Norman J， Smith P J. J. Pharm. Biomed. Anal .， 2011， 55（2）： 373-378
16 César I C， Ribeiro J A， Teixeira Lde S， Bellorio K B， de Abreu F C， Moreira J M， Chellini P R， Pianetti G A. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2011， 54（1）： 114-120
17 Pingale S G， Nerurkar K K， Pawar S S， Mangaonkar K V. Global J. Anal. Chem.， 2012， 3： 3
18 LI Ming， MA JiaChen， LI HongMei， XIONG XingChuang， JIANG You， HUANG ZeJian， FANG Xiang. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society， 2013， 34（3）： 186-192
李 明， 马家辰， 李红梅， 熊行创， 江 游， 黄泽建， 方 向. 质谱学报， 2013， 34（3）： 186-192
19 GUO YanLei， WU MingJun， LI WenJuan， JIANG Zheng， YE FangTing， YU Chao. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（7）： 1074-1079
郭延垒， 吴明军， 李文娟， 江 峥， 叶芳挺， 于 超. 分析化学， 2013， 41（7）： 1074-1079
20 ACTG guidelines for method development and validation based on （and including） FDA guidelines dated by 2001， Version 2 （2005）
21 Li Q G， Peggins J O， Fleckenstein L L， Masonic K， Heiffer M H， Brewer T G. J. Pharm. Pharmacol.， 1998， 50（2）： 173-182
摘 要 为了研究蒿甲醚在大鼠体内的药代动力学行为，应用液液萃取超高效液相色谱单四极杆静电场轨道阱串联质谱技术，建立了高灵敏度的大鼠血浆中蒿甲醚及其主要代谢产物双氢青蒿素的分析方法。以青蒿素为内标（Internal standard，I.S.），在正离子TargetedMS2检测模式下对蒿甲醚和双氢青蒿素进行定性和定量分析。检测离子对分别为m/z 316.2115/163.1117（蒿甲醚）、m/z 302.1958/163.1117（双氢青蒿素）和m/z 300.1803/209.1536（I.S.）；蒿甲醚和双氢青蒿素在2～200 μg/L范围内线性关系良好（R2>0.9990）；检出限为0.8 μg/L；定量限为2.0 μg/L；加标回收率分别为93.7%～103.7%和97.4%～104.7%；相对标准偏差均小于9%。本方法快速灵敏，重现性好，可用于蒿甲醚体内药代动力学研究。
关键词 蒿甲醚； 双氢青蒿素； 静电场轨道阱； 大鼠血浆； 药代动力学
1 引 言
疟疾是由疟原虫引起的可由雌性按蚊传染到人类的重大传染病，多发于非洲、南美等热带欠发达地区，严重威胁着人类的健康。在全球范围内，每年约五十亿人感染疟疾，其中一百多万人死于疟疾[1]。
蒿甲醚（Artemether，ARM）是天然产物青蒿素（Artemisinin，ART）的一种半合成衍生物，因具有比青蒿素更好的生物利用度而广泛用于临床疟疾治疗，蒿甲醚和青蒿素在体内代谢，迅速转化为双氢青蒿素（Dihydroartimisinin， DHA），DHA也具有抗疟活性[2]。为了研究蒿甲醚在模型动物体内的药代动力学，需要同时检测模型动物血浆中蒿甲醚和双氢青蒿素的浓度，建立特异性强、灵敏度高的分析方法。
目前，检测蒿甲醚的方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱质谱联用法和液相色谱质谱联用法。由于青蒿素衍生物分子中没有共轭结构，紫外吸收不明显，因此高效液相色谱法用紫外检测器时需要繁杂的柱后衍生过程才能达到体内药物含量检测所需的灵敏度[3，4]。应用电化学检测器可提高灵敏度，但是需要控制严格的厌氧环境，样品和流动相也都需要脱氧[5，6]。气相色谱质谱联用法可获得高效液相色谱法应用电化学检测器时的检测限，但是需要0.5～1.0 mL的血浆样品[7，8]。液相色谱质谱联用法因其特异性强、灵敏度高、样品无需衍生化处理等优点，近年来被广泛用于青蒿素衍生物的检测。其中高效液相色谱三重四级杆串联质谱技术应用最为广泛[2，9～17]。
静电场轨道阱是一种新兴的一种质谱质量分析器，具有较高的分辨率和质量准确度[18]，具备一级和二级高分辨质谱扫描模式，适用于复杂基质中代谢物的定性与定量分析[19]。目前，应用高效HPLC四级杆静电场轨道阱质谱联用技术做定量分析的报道较少，针对蒿甲醚及其代谢产物测定尚未见报道。本研究建立了超高效液相色谱四级杆静电场轨道阱质谱同时检测蒿甲醚及其主要代谢产物双氢青蒿素的方法。本方法简单快速，特异性强，回收率高，重现性好，并用于蒿甲醚在大鼠体内的药代动力学研究。
2 实验部分
2.1 仪器、材料与试剂
Q Exactive四级杆静电场轨道阱高分辨质谱系统、Dionex UltiMate 3000快速高效液相色谱系统、D11931超纯水系统（美国Thermo Fisher公司）；3K15型高速离心机（德国 Sigma 公司）；MS3型涡旋混合器（德国 IKA 公司）；XA105电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；EWHL388型超低温冰箱（中科美菱低温科技有限责任公司）。
甲醇、乙腈和乙酸乙酯（色谱纯，美国Sigma Aldrich公司）；乙酸铵（迪马科技有限公司）蒿甲醚（ARM）、双氢青蒿素（DHA）和青蒿素（ART）均购自于重庆华立武陵山制药有限公司；清洁级Wistar 大鼠（雄性，体重约200 g）购自北京海淀兴隆实验动物有限公司。
2.2 样品前处理
2.2.1 标准储备液和标准工作液的配制 准确称取ARM和DHA各5.00 mg，用甲醇分别定容至50 mL，配成100 mg/L的ARM储备液和DHA储备液，吸取ARM储备液和DHA储备液各1 mL，用甲醇定容至10 mL，得到ARM和DHA浓度均为10 mg/L的混合储备液。将混合储备液用甲醇逐级稀释成ARM和DHA浓度各为2000， 1000， 500， 200， 100， 50 和20 μg/L的系列工作液。将工作液分别再用大鼠空白血浆稀释10倍，即成ARM和DHA的浓度为200， 100， 50， 20， 10， 5和2 μg/L的标准工作液。将混合储备液，用大鼠空白血浆逐级稀释成180， 90和6 μg/L的标准质量控制工作液。
准确称取ART 5.00 mg，用甲醇定容至50 mL，配成100 mg/L的内标储备液，将此储备液用甲醇稀释为500 μg/L内标工作液。
4 结 论
本研究以超高效液相色谱四级杆静电场轨道阱质谱串联技术建立了大鼠血浆中ARM和DHA同时测定的分析方法，在TargetedMS2模式下，可以实现对ARM和DHA准确的定性和定量分析。本方法特异性强、灵敏度高、准确度好、需要样品量少、单个样品分析时间短，适用于生物基质中ARM及其代谢产物DHA的同时分析检测，为蒿甲醚的药代动力学研究提供技术参考。
References
1 Cobo F. Imported Infectious Deseases. Woodhead Publishing， 2014： 61-90
2 Hilhorst M J， Hendriks G， de Vries R， Hillewaert V， Verhaege T， van de Merbel N C. J. Chromatogr. B， 2014， 965： 45-53
3 Thomas C G， Ward S A， Edwards G. J. Chromatogr.， 1992， 583（1）： 131-136
4 César Ida C， Andrade Nogueira F H， Antnio Pianetti G. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2008， 48（3）： 951-954
5 Sandrenan N， Sioufi A， Godbillon J， Netter C， Donker M， van Valkenburg C. J. Chromatogr. B， 1997， 691（1）： 145-153
6 Karbwang J， NaBangchang K， Molunto P， Banmairuroi V， Congpuong K. J. Chromatogr. B， 1997， 690（12）： 259-265
7 Mohamed S S， Khalid S A， Ward S A， Wan T S， Tang H P， Zheng M， Haynes R K， Edwards G. J. Chromatogr. B， 1999， 731（2）： 251-260
8 Mithwani S， Aarons L， Kokwaro G O， Majid O， Muchohi S， Edwards G， Mohamed S， Marsh K， Watkins W. Br. J. Clin. Pharmacol.， 2003， 57（2）： 146-152
9 Souppart C， Gauducheau N， Sandrenan N， Richard F. J. Chromatogr. B， 2002， 774（2）： 195-203
10 Shi B， Yu Y Q， Li Z D， Zhang L， Zhong Y， Su S M， Liang S P. Chromatographia， 2006， 64（910）： 523-530
11 Hanpithakpong W， Kamanikom B， Singhasivanon P， White N J， Day N P， Lindegardh N. Bioanalysis， 2009， 1（1）： 37-46
12 Huang L， Jayewardene A L， Li X， Marzan F， Lizak P S， Aweeka F T. J. Pharm. Biomed . Anal.， 2009， 50（5）： 959-965
13 Raghunadha R S， Divi K R， Chandiran I S， Jayaveera K N. Journal of Pharmacy Research， 2010， 3（8）： 1943-1946
14 Magalhes I R， Jabor V A， Faria A M， Collins C H， Jardim I C， Bonato P S. Talanta， 2010， 81（3）： 941-947
15 Wiesner L， Govender K， Meredith S A， Norman J， Smith P J. J. Pharm. Biomed. Anal .， 2011， 55（2）： 373-378
16 César I C， Ribeiro J A， Teixeira Lde S， Bellorio K B， de Abreu F C， Moreira J M， Chellini P R， Pianetti G A. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2011， 54（1）： 114-120
17 Pingale S G， Nerurkar K K， Pawar S S， Mangaonkar K V. Global J. Anal. Chem.， 2012， 3： 3
18 LI Ming， MA JiaChen， LI HongMei， XIONG XingChuang， JIANG You， HUANG ZeJian， FANG Xiang. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society， 2013， 34（3）： 186-192
李 明， 马家辰， 李红梅， 熊行创， 江 游， 黄泽建， 方 向. 质谱学报， 2013， 34（3）： 186-192
19 GUO YanLei， WU MingJun， LI WenJuan， JIANG Zheng， YE FangTing， YU Chao. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（7）： 1074-1079
郭延垒， 吴明军， 李文娟， 江 峥， 叶芳挺， 于 超. 分析化学， 2013， 41（7）： 1074-1079
20 ACTG guidelines for method development and validation based on （and including） FDA guidelines dated by 2001， Version 2 （2005）
21 Li Q G， Peggins J O， Fleckenstein L L， Masonic K， Heiffer M H， Brewer T G. J. Pharm. Pharmacol.， 1998， 50（2）： 173-182
