同位素编码衍生—高效液相色谱串联质谱法测定果蔬样品中的羧酸类植物生长调节剂
蔡轶平等
摘 要 以d0/d310甲基吖啶酮2磺酰哌嗪（d0/d3MASPz）为同位素编码衍生试剂，建立了高效液相色谱串联质谱（HPLCMS/MS）快速测定果蔬中6种羧酸类植物生长调节剂的分析方法。分别以d0MASPz（轻型）和d3MASPz（重型）为衍生样品和对照品，混合后进行HPLCMS/MS分析。轻型和重型衍生物分别以[M+H]+ m/z 208.2和[M+H]+ m/z 211.2作为多级反应监测离子对，以重型衍生物作为相应轻型衍生物的内标物，建立定量分析方法。结果表明，在6.5 min内可实现6种分析物的完全分离，轻/重衍生物保留时间差异小于0.026 min， 6种分析物的轻/重信号强度比在10倍动态范围内线性关系良好，相关系数r>0.9991，检测限和定量限分别为0.19～0.34 μmol/L和0.53～0.96 μmol/L，相对标准偏差小于3.8%，标准加入的回收率为95.3%～105.5%之间。
关键词 同位素编码衍生； 高效液相色谱串联质谱； 植物生长调节剂
1 引 言
内源性植物激素是一类由植物自身代谢产生，在极低浓度下发挥明显生理效应的微量有机物质，影响植物的发芽、生根、开花、结实等生理活动[1]。在农业生产中，人们常使用一些结构和活性与内源性植物激素相似的化学物质作为低成本的替代品，用于调节植物生长和提高产量。为了规范这些外源性植物生长调节剂的应用，许多国家都制定了农产品中最小残留限量标准[2]。利用高效液相色谱串联质谱（HPLCMS/MS）可以同时实现多种植物生长调节剂的快速定量分析[3]。然而，基质效应严重影响HPLCMS/MS分析性能，难以获得可靠的定量结果。以稳定同位素标记物做内标，可以有效克服基质效应的影响，但商售同位素内标物种类有限，价格昂贵。近年来，同位素编码衍生技术备受关注，借助同位素编码衍生试剂，使具有相同官能团的一类分析物同时获得同位素衍生物，以此作为内标物进行定量分析，可以极大地降低同位素内标物的造价[4]。针对于胺基、醛基、羧基等官能团的同位素编码衍生试剂均有报道[5]，但应用于羧酸类植物生长调节剂的研究还很少[6，7]。
本研究制备了一对新型同位素编码衍生试剂d0/d310甲基吖啶酮2磺酰哌嗪（d0/d3MASPz），d0/d3MASPz以吖啶酮为母体，吖啶酮具有的分子内共振电离机制使得此试剂具有极强的质谱增敏作用[8]，此试剂以CH3/CD3为同位素编码部件，3个H/D编码原子既保证了低分辨质谱对轻/重信号的区分度，又能最大程度地减小色谱分离过程中的同位素效应。本研究以d0/d3MASPz为同位素编码衍生试剂，建立了测定6种羧酸类植物生长调节剂的同位素内标定量方法，成功用于果蔬样品中植物生长调节剂的快速、灵敏、准确测定。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
1290型超高效液相色谱仪，6460型三重四级杆串联质谱仪，配备电喷雾电离源（ESI），Masshunter工作站软件（Agilent公司）。
d0MASPz（轻型）和d3MASPz（重型）由本实验室自制；吲哚乙酸（IAA）、吲哚丙酸（IPA）、吲哚丁酸（IBA）、1萘乙酸（1NAA）、2萘乙酸（2NAA）、脱落酸（ABA），均购自Aladdin公司；乙腈（色谱纯，美国Sigma公司）；1乙基（3二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）等均为分析纯。
2.2 d0/d3MASPz的制备
以本实验自制的d0/d310甲基吖啶酮2磺酰氯（d0/d3MASC）[9]为原料制备d0/d3MASPz。具体步骤如下：称取d0/d3MASC固体1 g溶于200 mL乙腈中，向其中加入30 mL水，1 g 哌嗪固体，60 ℃反应20 min。反应后旋蒸至干，水洗，抽滤，得黄色固体，用95%乙醇重结晶3次，纯度大于99.9%。
2.3 溶液的配制
用乙腈配制1.0×10 3 mol/L植物生长调节剂标准储备液，用乙腈稀释至所需的浓度系列。称取d0/d3MASPz固体0.0034 g，用乙腈溶解并定容至10 mL，浓度为1.0×10 3 mol/L；称取EDC·HCl固体0.1 g，用乙腈溶解并定容至10 mL，浓度为5.0×10 2 mol/L。
2.4 同位素编码衍生
取一支2 mL安瓿瓶，依次加入150 μL d0MASPz溶液、30 μL EDC溶液、25 μL植物生长调节剂标品，密封，在60 ℃水浴中反应60 min；另取一支2 mL安瓿瓶，采取同样步骤，以d3MASPz衍生另一份标准品或样品。两份衍生液冷却后混合，加入等体积水和硫酸铵固体（0.03 g）进行盐析辅助萃取，取有机相0.5 μL进样分析，衍生反应示意图见图1（A）。
2.5 色谱质谱条件
色谱条件：Agilent ZORBAX Eclipse C18色谱柱（50 mm ×2.1 mm， 1.8 μm），流动相A为95%乙腈（含0.1 %甲酸），流动相B为含0.1%甲酸的乙腈，流速：0.2 mL/min， 梯度洗脱程序：0 min （40% B）→6 min （60% B）→10 min （100% B）。
质谱条件：ESI电离源正离子模式，干燥气温度300 ℃，流速9 L/min，雾化气压力40 psi（278 kPa），鞘气温度250 ℃，流速8 L/min，毛细管电压3.5 kV，碎裂电压、碰撞能及MRM参数见表1。
3 结果与讨论
3.1 质谱检测及色谱分离
在2.5节所述的条件下，衍生物均显示高丰度的[M+H]+信号和规则的MS/MS碎片，MS和MS/MS数据见表2，衍生物电离及裂解模式见图1B。轻型衍生物主要产生m/z 208.2和224.2的碎片，重型衍生物主要产生m/z 211.2和227.2的碎片。以[M+H]+ m/z 208.2作为轻型衍生物的MRM监测离子，[M+H]+ m/z 211.2作为重型衍生物的MRM监测离子，轻型和重衍生物分离的离子流色谱图见图2A，各衍生物的保留时间见表1。结果表明，在6.5 min内可实现6种分析物的完全分离，轻/重衍生物保留时间差异小于0.026 min。
3.2 衍生化方法评价
本实验考察了衍生化方法的线性、灵敏度、精密度和准确度。浓度为1～1000 μmol/L的系列标准溶液经d0MASPz衍生后进行分析，结果表明， 各植物生长调节剂均具有良好的线性响应，相关系数均大于0.9955。检出限（LOD， S/N= 3）和定量限（LOQ， S/N=10）分别在0.19～0.34 μmol/L和0.53～0.96 μmol/L范围内。对10.0 μmol/L的标准品重复分析（n= 6），相对标准偏差小于3.8%。对5， 50和500 μmol/L浓度水平的标准品进行分析，准确度在97.5%～103.8%之间。结果表明，精密度和准确度良好，能够满足实际检测需求。
3.3 同位素内标定量分析
定量分析模式参考文献[10]，并通过两种策略对内标定量法的可靠性进行评价。（1）用d0MASPz衍生3份浓度分别为5×10 5 mol/L， 2.5×10 5 mol/L和1.25×10 5 mol/L的标准品，同时使用d3MASPz衍生3份浓度均为2.5×10 5 mol/L标准品，将轻/重衍液按体积比1∶1混合，对3份混合液进行分析。结果表明，在以上3个比率水平上，6种植物生长调节剂的轻/重衍生物质谱信号强度比均接近理论值（见图3A）；（2）两份浓度为2.5×10 5 mol/L的植物生长调节剂标准品，分别用d0MASPz 和d3MASPz进行同位素编码衍生，将两份衍生液按照体积比1∶10， 1∶5， 1∶2， 1∶1， 2∶1， 5∶1和10∶1混合后分析，以轻/重衍生物质谱信号强度之比对体积比做校正曲线，6种分析物线性良好，相关系数r≥ 0.9991，曲线斜率在0.9923～1.0647之间（图3B）。以上数据表明，本实验建立的基于同位素编码衍生的内标定量方法可实现6种植物生长调节剂的快速准确测定，以斜率作为轻/重衍生物质谱响应的相对校正因子，可以方便地实现样品中分析物的绝对定量分析。
3.4 实际样品分析
市场购得黄瓜、西红柿样品，根据文献[11]的方法提取植物生长调节剂，提取液按2.4节方法进行同位素编码衍生后，进行HPLCMS/MS分析。典型样品MRM色谱图见图2B，测得各植物生长调节剂的含量见表2。西红柿样品中吲哚乙酸、吲哚丁酸植物生长素含量较高，黄瓜样品中萘乙酸残留量较高。向样品中添加标准对照品，测得方法回收率在95.3%～105.5%之间。本方法快速、准确，满足测定果蔬样品中植物生长调节剂残留的要求，可为规范植物生长调节剂的使用提供技术支持。
References
1 ZHOU YanMing， XIN Xue. Food Science， 2010， 31（18）： 301-304
周艳明， 忻 雪. 食品科学， 2010， 31（18）： 301-304
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欧阳玥， 孙晓红， 闫 静， 褚金芳， 闫存玉. 科学通报， 2013， 58（7）： 2762-2778
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6 Huang Y Q， Liu J Q， Gong H， Yang J， Li Y， Feng Y Q. Analyst ， 2011， 136（7）： 1515-1522
7 Sun X， Ouyang Y， Chu J， Yan J， Yu Y， Li X， Yang J， Yan C. J. Chromatogr. A， 2014， 1338： 67-76
8 ZHAO HuaiXin， SUN XueJun， SUN ZhiWei， HU BaoJun， LIU QinZe， ZHAO XinQuan， YOU JinMao. Chinese J. Anal. Chem.， 2009， 37（2）： 187-193
赵怀鑫， 孙学军， 孙志伟， 户宝军， 刘钦泽， 赵新全， 尤进茂. 分析化学， 2009， 37（2）： 187-193
9 Zhang S， You J， Ning S， Suo Y， Song C. J. Chromatogr. A， 2013， 1280： 84-91
10 Dai W， Huang Q， Yin P， Li J， Zhou J， Kong H， Zhao C， Lu X， Xu G. Anal. Chem.， 2012， 84（23）： 10245-10251
11 ZENG QingQian， CHEN HouBin， LU CaiHao， LI JianGuo. Journal of Fruit Science， 2006， 23： 145-148
曾庆钱， 陈厚彬， 鲁才浩， 李建国. 果树学报， 2006， 23（1）： 145-148
Abstract A method for determination of 6 plant growth regulators by high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry （HPLCMS/MS） coupled with isotopecoded derivatization was developed. d010Methylacridone2sulfonyl piperazine （d0MASPz， light form） and d310methylacridone2sulfonyl piperazine （d3MASPz， heavy form） were prepared as isotopecoded derivatization reagents for carboxyl compound. The carboxyl plant growth regulator standards and real samples were derivatized by d0MASPz and d3MASPz， respectively. The obtained solutions were mixed at a certain ratio， and then injected for HPLCMS/MS analysis. The light and heavy derivatives were monitored with transitions of [M+H]+ m/z 208.2 and [M+H]+ m/z 211.2，respectively. With heavy derivative as internal standard for corresponding light derivative， the global isotope internal standard quantification for 6 plant growth regulators was achieved. The results indicated that the proposed isotopecoded derivatization method could provide relative quantitative data with adequate linearity in a 10fold dynamic range （R=0.9991）. The detection and quantitation limits were 0.19-0.34 μmol/L and 0.53-0.96 μmol/L， respectively. The relative standard deviations were ≤3.8%， and the accuracies ranged from 97.5% to 103.8%.
Keywords Isotopecoded derivatization； High performance liquid chromatographytandem mass spectrometry； Plant growth regulators
（Received 6 October 2014； accepted 24 December 2014）
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 21305076， 31300292） and the Natural Science Foundation of Shandong Province， China （No. ZR2012BQ022）
摘 要 以d0/d310甲基吖啶酮2磺酰哌嗪（d0/d3MASPz）为同位素编码衍生试剂，建立了高效液相色谱串联质谱（HPLCMS/MS）快速测定果蔬中6种羧酸类植物生长调节剂的分析方法。分别以d0MASPz（轻型）和d3MASPz（重型）为衍生样品和对照品，混合后进行HPLCMS/MS分析。轻型和重型衍生物分别以[M+H]+ m/z 208.2和[M+H]+ m/z 211.2作为多级反应监测离子对，以重型衍生物作为相应轻型衍生物的内标物，建立定量分析方法。结果表明，在6.5 min内可实现6种分析物的完全分离，轻/重衍生物保留时间差异小于0.026 min， 6种分析物的轻/重信号强度比在10倍动态范围内线性关系良好，相关系数r>0.9991，检测限和定量限分别为0.19～0.34 μmol/L和0.53～0.96 μmol/L，相对标准偏差小于3.8%，标准加入的回收率为95.3%～105.5%之间。
关键词 同位素编码衍生； 高效液相色谱串联质谱； 植物生长调节剂
1 引 言
内源性植物激素是一类由植物自身代谢产生，在极低浓度下发挥明显生理效应的微量有机物质，影响植物的发芽、生根、开花、结实等生理活动[1]。在农业生产中，人们常使用一些结构和活性与内源性植物激素相似的化学物质作为低成本的替代品，用于调节植物生长和提高产量。为了规范这些外源性植物生长调节剂的应用，许多国家都制定了农产品中最小残留限量标准[2]。利用高效液相色谱串联质谱（HPLCMS/MS）可以同时实现多种植物生长调节剂的快速定量分析[3]。然而，基质效应严重影响HPLCMS/MS分析性能，难以获得可靠的定量结果。以稳定同位素标记物做内标，可以有效克服基质效应的影响，但商售同位素内标物种类有限，价格昂贵。近年来，同位素编码衍生技术备受关注，借助同位素编码衍生试剂，使具有相同官能团的一类分析物同时获得同位素衍生物，以此作为内标物进行定量分析，可以极大地降低同位素内标物的造价[4]。针对于胺基、醛基、羧基等官能团的同位素编码衍生试剂均有报道[5]，但应用于羧酸类植物生长调节剂的研究还很少[6，7]。
本研究制备了一对新型同位素编码衍生试剂d0/d310甲基吖啶酮2磺酰哌嗪（d0/d3MASPz），d0/d3MASPz以吖啶酮为母体，吖啶酮具有的分子内共振电离机制使得此试剂具有极强的质谱增敏作用[8]，此试剂以CH3/CD3为同位素编码部件，3个H/D编码原子既保证了低分辨质谱对轻/重信号的区分度，又能最大程度地减小色谱分离过程中的同位素效应。本研究以d0/d3MASPz为同位素编码衍生试剂，建立了测定6种羧酸类植物生长调节剂的同位素内标定量方法，成功用于果蔬样品中植物生长调节剂的快速、灵敏、准确测定。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
1290型超高效液相色谱仪，6460型三重四级杆串联质谱仪，配备电喷雾电离源（ESI），Masshunter工作站软件（Agilent公司）。
d0MASPz（轻型）和d3MASPz（重型）由本实验室自制；吲哚乙酸（IAA）、吲哚丙酸（IPA）、吲哚丁酸（IBA）、1萘乙酸（1NAA）、2萘乙酸（2NAA）、脱落酸（ABA），均购自Aladdin公司；乙腈（色谱纯，美国Sigma公司）；1乙基（3二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）等均为分析纯。
2.2 d0/d3MASPz的制备
以本实验自制的d0/d310甲基吖啶酮2磺酰氯（d0/d3MASC）[9]为原料制备d0/d3MASPz。具体步骤如下：称取d0/d3MASC固体1 g溶于200 mL乙腈中，向其中加入30 mL水，1 g 哌嗪固体，60 ℃反应20 min。反应后旋蒸至干，水洗，抽滤，得黄色固体，用95%乙醇重结晶3次，纯度大于99.9%。
2.3 溶液的配制
用乙腈配制1.0×10 3 mol/L植物生长调节剂标准储备液，用乙腈稀释至所需的浓度系列。称取d0/d3MASPz固体0.0034 g，用乙腈溶解并定容至10 mL，浓度为1.0×10 3 mol/L；称取EDC·HCl固体0.1 g，用乙腈溶解并定容至10 mL，浓度为5.0×10 2 mol/L。
2.4 同位素编码衍生
取一支2 mL安瓿瓶，依次加入150 μL d0MASPz溶液、30 μL EDC溶液、25 μL植物生长调节剂标品，密封，在60 ℃水浴中反应60 min；另取一支2 mL安瓿瓶，采取同样步骤，以d3MASPz衍生另一份标准品或样品。两份衍生液冷却后混合，加入等体积水和硫酸铵固体（0.03 g）进行盐析辅助萃取，取有机相0.5 μL进样分析，衍生反应示意图见图1（A）。
2.5 色谱质谱条件
色谱条件：Agilent ZORBAX Eclipse C18色谱柱（50 mm ×2.1 mm， 1.8 μm），流动相A为95%乙腈（含0.1 %甲酸），流动相B为含0.1%甲酸的乙腈，流速：0.2 mL/min， 梯度洗脱程序：0 min （40% B）→6 min （60% B）→10 min （100% B）。
质谱条件：ESI电离源正离子模式，干燥气温度300 ℃，流速9 L/min，雾化气压力40 psi（278 kPa），鞘气温度250 ℃，流速8 L/min，毛细管电压3.5 kV，碎裂电压、碰撞能及MRM参数见表1。
3 结果与讨论
3.1 质谱检测及色谱分离
在2.5节所述的条件下，衍生物均显示高丰度的[M+H]+信号和规则的MS/MS碎片，MS和MS/MS数据见表2，衍生物电离及裂解模式见图1B。轻型衍生物主要产生m/z 208.2和224.2的碎片，重型衍生物主要产生m/z 211.2和227.2的碎片。以[M+H]+ m/z 208.2作为轻型衍生物的MRM监测离子，[M+H]+ m/z 211.2作为重型衍生物的MRM监测离子，轻型和重衍生物分离的离子流色谱图见图2A，各衍生物的保留时间见表1。结果表明，在6.5 min内可实现6种分析物的完全分离，轻/重衍生物保留时间差异小于0.026 min。
3.2 衍生化方法评价
本实验考察了衍生化方法的线性、灵敏度、精密度和准确度。浓度为1～1000 μmol/L的系列标准溶液经d0MASPz衍生后进行分析，结果表明， 各植物生长调节剂均具有良好的线性响应，相关系数均大于0.9955。检出限（LOD， S/N= 3）和定量限（LOQ， S/N=10）分别在0.19～0.34 μmol/L和0.53～0.96 μmol/L范围内。对10.0 μmol/L的标准品重复分析（n= 6），相对标准偏差小于3.8%。对5， 50和500 μmol/L浓度水平的标准品进行分析，准确度在97.5%～103.8%之间。结果表明，精密度和准确度良好，能够满足实际检测需求。
3.3 同位素内标定量分析
定量分析模式参考文献[10]，并通过两种策略对内标定量法的可靠性进行评价。（1）用d0MASPz衍生3份浓度分别为5×10 5 mol/L， 2.5×10 5 mol/L和1.25×10 5 mol/L的标准品，同时使用d3MASPz衍生3份浓度均为2.5×10 5 mol/L标准品，将轻/重衍液按体积比1∶1混合，对3份混合液进行分析。结果表明，在以上3个比率水平上，6种植物生长调节剂的轻/重衍生物质谱信号强度比均接近理论值（见图3A）；（2）两份浓度为2.5×10 5 mol/L的植物生长调节剂标准品，分别用d0MASPz 和d3MASPz进行同位素编码衍生，将两份衍生液按照体积比1∶10， 1∶5， 1∶2， 1∶1， 2∶1， 5∶1和10∶1混合后分析，以轻/重衍生物质谱信号强度之比对体积比做校正曲线，6种分析物线性良好，相关系数r≥ 0.9991，曲线斜率在0.9923～1.0647之间（图3B）。以上数据表明，本实验建立的基于同位素编码衍生的内标定量方法可实现6种植物生长调节剂的快速准确测定，以斜率作为轻/重衍生物质谱响应的相对校正因子，可以方便地实现样品中分析物的绝对定量分析。
3.4 实际样品分析
市场购得黄瓜、西红柿样品，根据文献[11]的方法提取植物生长调节剂，提取液按2.4节方法进行同位素编码衍生后，进行HPLCMS/MS分析。典型样品MRM色谱图见图2B，测得各植物生长调节剂的含量见表2。西红柿样品中吲哚乙酸、吲哚丁酸植物生长素含量较高，黄瓜样品中萘乙酸残留量较高。向样品中添加标准对照品，测得方法回收率在95.3%～105.5%之间。本方法快速、准确，满足测定果蔬样品中植物生长调节剂残留的要求，可为规范植物生长调节剂的使用提供技术支持。
References
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11 ZENG QingQian， CHEN HouBin， LU CaiHao， LI JianGuo. Journal of Fruit Science， 2006， 23： 145-148
曾庆钱， 陈厚彬， 鲁才浩， 李建国. 果树学报， 2006， 23（1）： 145-148
Abstract A method for determination of 6 plant growth regulators by high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry （HPLCMS/MS） coupled with isotopecoded derivatization was developed. d010Methylacridone2sulfonyl piperazine （d0MASPz， light form） and d310methylacridone2sulfonyl piperazine （d3MASPz， heavy form） were prepared as isotopecoded derivatization reagents for carboxyl compound. The carboxyl plant growth regulator standards and real samples were derivatized by d0MASPz and d3MASPz， respectively. The obtained solutions were mixed at a certain ratio， and then injected for HPLCMS/MS analysis. The light and heavy derivatives were monitored with transitions of [M+H]+ m/z 208.2 and [M+H]+ m/z 211.2，respectively. With heavy derivative as internal standard for corresponding light derivative， the global isotope internal standard quantification for 6 plant growth regulators was achieved. The results indicated that the proposed isotopecoded derivatization method could provide relative quantitative data with adequate linearity in a 10fold dynamic range （R=0.9991）. The detection and quantitation limits were 0.19-0.34 μmol/L and 0.53-0.96 μmol/L， respectively. The relative standard deviations were ≤3.8%， and the accuracies ranged from 97.5% to 103.8%.
Keywords Isotopecoded derivatization； High performance liquid chromatographytandem mass spectrometry； Plant growth regulators
（Received 6 October 2014； accepted 24 December 2014）
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 21305076， 31300292） and the Natural Science Foundation of Shandong Province， China （No. ZR2012BQ022）
