基于聚(3,4—乙烯二氧噻吩)/天青Ⅰ复合物薄膜和纳米金修饰的电流型甲胎蛋白免疫传感器的研究

刘珂珂等
摘要 研制了一种基于聚(3,4乙烯二氧噻吩)(PEDOT)与天青Ⅰ(Azure Ⅰ)为基体的电化学免疫传感器,可灵敏检测甲胎蛋白(AFP)。在铂盘电极表面,电化学聚合PEDOT为基体,利用静电组装技术固定Azure Ⅰ和纳米金颗粒(nanoAus),将甲胎蛋白抗体(antiAFP)组装到nanoAus的表面。采用辣根过氧化物酶(HRP)封闭非特异性吸附位点,制得电流型AFP免疫传感器。采用循环伏安、扫描电镜技术研究组装过程及电极性质,探讨了影响免疫传感器性能的因素。在优化实验条件下,电极响应与AFP的浓度在0.01~120 μg/L的范围内呈线性关系,检出限为0.003 μg/L。取临床血清样品用本方法检测AFP含量,得到的结果与临床常用的ELISA法得到的结果无显著性差异。
关键词 聚(3,4乙烯二氧噻吩); 电化学免疫传感器; 甲胎蛋白; 天青Ⅰ
1引言
血清中甲胎蛋白(AFP)的含量是临床用于原发性肝癌和畸胎瘤的早期诊断、疗效观察和愈后判断的重要指标。目前,临床用于AFP检测的方法有酶联免疫吸附法(ELISA)、放射免疫测定法、化学发光法、荧光免疫法等[1,2],但存在灵敏度不高、步骤繁琐或者放射性危害等不足。电流型免疫传感器将电化学检测与ELISA的特点结合,具有灵敏度高、操作简便、干扰少等特点。在电化学免疫分析中,标记抗体的数量直接影响免疫传感器的灵敏度[3~6]。因此, 开发新型的抗体标记材料,增加抗体的负载量,是提高免疫传感器灵敏度的关键。
聚(3,4乙烯二氧噻吩)(PEDOT)是一类功能高分子,可直接用做电极功能基质膜[7,8]。天青Ⅰ(Azure Ⅰ)作为一种生物染料,是一种比较活泼的电子转移体 [9,10]。基于以上原理,本实验研究了PEDOTAzure Ⅰ纳米复合物、纳米金(nanoAus)共修饰于铂盘电极表面固定甲胎蛋白抗体(antiAFP)的电流型免疫传感器。该免疫传感器基于PEDOT与Azure Ⅰ的协同效应,促进酶活性中心与电极表面的电子传递;同时,基于静电吸附的原理将带负电荷的nanoAus固定在PEDOT/Azure Ⅰ复合物表面,固定antiAFP;用辣根过氧化物酶(HRP)代替常用的牛血清蛋白(BSA)封闭非特异性吸附位点。由于PEDOT具有疏松多孔的纳米结构,可有效增大电极的比表面积,增加抗体的固载量;同时HRP对H2O2有电催化作用,可扩增电流响应,这种纳米技术增强与酶催化底物信号增强的联用,可实现信号双重放大,制得高灵敏的电化学免疫传感器。
2实验部分
2.1仪器与试剂
CHI 660B电化学工作站(上海辰华仪器公司),S4800 扫描电子显微镜(Hitachi公司)。
EDOT(纯度>97%,Bayer AG)。Azure Ⅰ(Coleman & Bell公司), AFP试剂盒(郑州博赛生物技术研究所),HRP(Sigma公司),H2O2(30%, w/V,上海化学试剂公司)。[Bmim]BF4(>99%,兰州绿色化学与催化中心),氯金酸(Sigma公司)。其它试剂均为分析纯。
nanoAus在100 ℃的温度下还原氯金酸制得[11],电镜结构表征其平均粒径为16 nm。所有溶液均采用超纯水配制。
2.2免疫传感器的制备
铂盘电极(=1 mm)经氧化铝粉末抛光成镜面,超纯水冲洗,然后依次用乙醇和超纯水超声清洗,氮气吹干。清洗好的电极浸入含有0.1 mol/L EDOT的[Bmim]BF4中,+1.25 V (vs Ag wire)的工作电位恒电位电聚合得到蓝色的PEDOT薄膜,用超纯水洗净;取2 μL 5% Azure Ⅰ溶液滴涂于修饰电极表面,晾干后,洗去结合不够稳定的的Azure Ⅰ,浸入nanoAus溶液中浸泡8 h;将该修饰电极置于30 μL 含有0.25 mg/mL antiAFP的0.05 mol/L PBS溶液(pH 7.4)中,于4 ℃放置过夜;用pH 7.4的PBS溶液洗净,浸入含0.4 mg/mL HRP的0.05 mol/L PBS溶液(pH 7.4)中,4 ℃放置4 h。将制备好的电极在4 ℃下保存备用。该免疫传感器的制备过程见图1。
2.3免疫传感器的检测原理及方法
通过对免疫传感器与待测抗原发生特异性结合前后的电流变化值来对抗原进行定量分析。当待测抗原与抗体特异性结合后,生成的免疫复合物阻碍了H2O2靠近酶催化中,响应电流下降,电流下降值会随着抗原浓度的增加而增大。
电化学免疫传感器的检测采用循环伏安法(CV),以免疫电极为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,铂片为对电极。每次实验前通氮气30 min,整个实验过程保持在氮气氛围中。扫描电位为-0.6~0.3 V,扫速为50 mV/s。免疫测定时,将修饰有抗体的工作电极置于不同浓度的抗原溶液中孵育20 min(25 ℃),然后取出,用0.05 mol/L PBS溶液(pH 7.4)洗净,浸入含有2.5 mmol/L H2O2的PBS溶液(0.1 mol/L, pH 6.5)中,进行CV实验。
3结果与讨论
3.1免疫传感器的电化学表征
用CV法研究了电极在不同修饰状态下的电化学行为(图2)。从图2可知,当铂电极表面电聚合修饰一层PEDOT薄膜后,循环伏安电流明显增加(曲线b),说明在离子液体电解液中聚合得到的PEDOT具有良好的电子传递性能[12,13]。当修饰了一层Azure Ⅰ后,电极呈现一对峰形良好的氧化还原峰(曲线c),说明Azure Ⅰ在电极表面形成了很好的导电膜。当nanoAus修饰在电极上后,氧化还原峰电流进一步增大(曲线d),这是由于nanoAus的电子通道作用,有助于电极表面电子的传输。当antiAFP(曲线e)进一步修饰在电极上,由于蛋白的绝缘性,阻碍电子的传输,氧化还原峰电流明显下降。最后,用HRP封闭电极上的活性位点,氧化还原峰电流进一步减小(曲线f)。
3.2免疫传感器的形貌表征
采用扫描电镜(SEM)技术对组装过程进行了形貌表征。图3为不同修饰电极的SEM图。从图3a可见,离子液体中聚合得到的PEDOT具有疏松多孔的网状结构。这是由于离子液体较高的粘度,降低了单体的扩散速率,从而有助于形成多层的多孔网状结构[14]。该材料具有较大的比表面积,可有效增加电极的比表面积,提高电活性物质Azure Ⅰ和antiAFP的固载量,加快电活性物质与电极之间的电子传递,提高免疫传感器的灵敏度。经AzureⅠ修饰后,整个表面交联形成一个比较致密的网状结构(图3b)。当nanoAus修饰到电极表面,可以观察到表面覆盖了一层粒径为10Symbolm@@ 8 m的颗粒(图3c)。 antiAFP被吸附到修饰电极上时由于蛋白的绝缘性,其表面变得模糊,表明antiAFP已成功修饰到电极表面(图3d)。
3.3免疫传感器的催化特性
修饰在电极表面的HRP具有两方面作用,一是封闭电极表面未被占据的活性点,避免非特异性反应;二是基于HRP对H2O2的催化作用来放大免疫反应信号。图4a为修饰电极在pH 6.5的PBS中添加以及未添加H2O2的CV图。当溶液中不含有H2O2时,曲线2出现一对Azure Ⅰ的氧化还原峰;当加入2.5 mmol/L H2O2后(曲线1),氧化电流减小,还原峰电流从2.3 μA增加到3.7 μA,说明采用HRP代替BSA封闭活性位点的同时还可以放大电流信号[9]。
摘要 研制了一种基于聚(3,4乙烯二氧噻吩)(PEDOT)与天青Ⅰ(Azure Ⅰ)为基体的电化学免疫传感器,可灵敏检测甲胎蛋白(AFP)。在铂盘电极表面,电化学聚合PEDOT为基体,利用静电组装技术固定Azure Ⅰ和纳米金颗粒(nanoAus),将甲胎蛋白抗体(antiAFP)组装到nanoAus的表面。采用辣根过氧化物酶(HRP)封闭非特异性吸附位点,制得电流型AFP免疫传感器。采用循环伏安、扫描电镜技术研究组装过程及电极性质,探讨了影响免疫传感器性能的因素。在优化实验条件下,电极响应与AFP的浓度在0.01~120 μg/L的范围内呈线性关系,检出限为0.003 μg/L。取临床血清样品用本方法检测AFP含量,得到的结果与临床常用的ELISA法得到的结果无显著性差异。
关键词 聚(3,4乙烯二氧噻吩); 电化学免疫传感器; 甲胎蛋白; 天青Ⅰ
1引言
血清中甲胎蛋白(AFP)的含量是临床用于原发性肝癌和畸胎瘤的早期诊断、疗效观察和愈后判断的重要指标。目前,临床用于AFP检测的方法有酶联免疫吸附法(ELISA)、放射免疫测定法、化学发光法、荧光免疫法等[1,2],但存在灵敏度不高、步骤繁琐或者放射性危害等不足。电流型免疫传感器将电化学检测与ELISA的特点结合,具有灵敏度高、操作简便、干扰少等特点。在电化学免疫分析中,标记抗体的数量直接影响免疫传感器的灵敏度[3~6]。因此, 开发新型的抗体标记材料,增加抗体的负载量,是提高免疫传感器灵敏度的关键。
聚(3,4乙烯二氧噻吩)(PEDOT)是一类功能高分子,可直接用做电极功能基质膜[7,8]。天青Ⅰ(Azure Ⅰ)作为一种生物染料,是一种比较活泼的电子转移体 [9,10]。基于以上原理,本实验研究了PEDOTAzure Ⅰ纳米复合物、纳米金(nanoAus)共修饰于铂盘电极表面固定甲胎蛋白抗体(antiAFP)的电流型免疫传感器。该免疫传感器基于PEDOT与Azure Ⅰ的协同效应,促进酶活性中心与电极表面的电子传递;同时,基于静电吸附的原理将带负电荷的nanoAus固定在PEDOT/Azure Ⅰ复合物表面,固定antiAFP;用辣根过氧化物酶(HRP)代替常用的牛血清蛋白(BSA)封闭非特异性吸附位点。由于PEDOT具有疏松多孔的纳米结构,可有效增大电极的比表面积,增加抗体的固载量;同时HRP对H2O2有电催化作用,可扩增电流响应,这种纳米技术增强与酶催化底物信号增强的联用,可实现信号双重放大,制得高灵敏的电化学免疫传感器。
2实验部分
2.1仪器与试剂
CHI 660B电化学工作站(上海辰华仪器公司),S4800 扫描电子显微镜(Hitachi公司)。
EDOT(纯度>97%,Bayer AG)。Azure Ⅰ(Coleman & Bell公司), AFP试剂盒(郑州博赛生物技术研究所),HRP(Sigma公司),H2O2(30%, w/V,上海化学试剂公司)。[Bmim]BF4(>99%,兰州绿色化学与催化中心),氯金酸(Sigma公司)。其它试剂均为分析纯。
nanoAus在100 ℃的温度下还原氯金酸制得[11],电镜结构表征其平均粒径为16 nm。所有溶液均采用超纯水配制。
2.2免疫传感器的制备
铂盘电极(=1 mm)经氧化铝粉末抛光成镜面,超纯水冲洗,然后依次用乙醇和超纯水超声清洗,氮气吹干。清洗好的电极浸入含有0.1 mol/L EDOT的[Bmim]BF4中,+1.25 V (vs Ag wire)的工作电位恒电位电聚合得到蓝色的PEDOT薄膜,用超纯水洗净;取2 μL 5% Azure Ⅰ溶液滴涂于修饰电极表面,晾干后,洗去结合不够稳定的的Azure Ⅰ,浸入nanoAus溶液中浸泡8 h;将该修饰电极置于30 μL 含有0.25 mg/mL antiAFP的0.05 mol/L PBS溶液(pH 7.4)中,于4 ℃放置过夜;用pH 7.4的PBS溶液洗净,浸入含0.4 mg/mL HRP的0.05 mol/L PBS溶液(pH 7.4)中,4 ℃放置4 h。将制备好的电极在4 ℃下保存备用。该免疫传感器的制备过程见图1。
2.3免疫传感器的检测原理及方法
通过对免疫传感器与待测抗原发生特异性结合前后的电流变化值来对抗原进行定量分析。当待测抗原与抗体特异性结合后,生成的免疫复合物阻碍了H2O2靠近酶催化中,响应电流下降,电流下降值会随着抗原浓度的增加而增大。
电化学免疫传感器的检测采用循环伏安法(CV),以免疫电极为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,铂片为对电极。每次实验前通氮气30 min,整个实验过程保持在氮气氛围中。扫描电位为-0.6~0.3 V,扫速为50 mV/s。免疫测定时,将修饰有抗体的工作电极置于不同浓度的抗原溶液中孵育20 min(25 ℃),然后取出,用0.05 mol/L PBS溶液(pH 7.4)洗净,浸入含有2.5 mmol/L H2O2的PBS溶液(0.1 mol/L, pH 6.5)中,进行CV实验。
3结果与讨论
3.1免疫传感器的电化学表征
用CV法研究了电极在不同修饰状态下的电化学行为(图2)。从图2可知,当铂电极表面电聚合修饰一层PEDOT薄膜后,循环伏安电流明显增加(曲线b),说明在离子液体电解液中聚合得到的PEDOT具有良好的电子传递性能[12,13]。当修饰了一层Azure Ⅰ后,电极呈现一对峰形良好的氧化还原峰(曲线c),说明Azure Ⅰ在电极表面形成了很好的导电膜。当nanoAus修饰在电极上后,氧化还原峰电流进一步增大(曲线d),这是由于nanoAus的电子通道作用,有助于电极表面电子的传输。当antiAFP(曲线e)进一步修饰在电极上,由于蛋白的绝缘性,阻碍电子的传输,氧化还原峰电流明显下降。最后,用HRP封闭电极上的活性位点,氧化还原峰电流进一步减小(曲线f)。
3.2免疫传感器的形貌表征
采用扫描电镜(SEM)技术对组装过程进行了形貌表征。图3为不同修饰电极的SEM图。从图3a可见,离子液体中聚合得到的PEDOT具有疏松多孔的网状结构。这是由于离子液体较高的粘度,降低了单体的扩散速率,从而有助于形成多层的多孔网状结构[14]。该材料具有较大的比表面积,可有效增加电极的比表面积,提高电活性物质Azure Ⅰ和antiAFP的固载量,加快电活性物质与电极之间的电子传递,提高免疫传感器的灵敏度。经AzureⅠ修饰后,整个表面交联形成一个比较致密的网状结构(图3b)。当nanoAus修饰到电极表面,可以观察到表面覆盖了一层粒径为10Symbolm@@ 8 m的颗粒(图3c)。 antiAFP被吸附到修饰电极上时由于蛋白的绝缘性,其表面变得模糊,表明antiAFP已成功修饰到电极表面(图3d)。
3.3免疫传感器的催化特性
修饰在电极表面的HRP具有两方面作用,一是封闭电极表面未被占据的活性点,避免非特异性反应;二是基于HRP对H2O2的催化作用来放大免疫反应信号。图4a为修饰电极在pH 6.5的PBS中添加以及未添加H2O2的CV图。当溶液中不含有H2O2时,曲线2出现一对Azure Ⅰ的氧化还原峰;当加入2.5 mmol/L H2O2后(曲线1),氧化电流减小,还原峰电流从2.3 μA增加到3.7 μA,说明采用HRP代替BSA封闭活性位点的同时还可以放大电流信号[9]。
摘要 研制了一种基于聚(3,4乙烯二氧噻吩)(PEDOT)与天青Ⅰ(Azure Ⅰ)为基体的电化学免疫传感器,可灵敏检测甲胎蛋白(AFP)。在铂盘电极表面,电化学聚合PEDOT为基体,利用静电组装技术固定Azure Ⅰ和纳米金颗粒(nanoAus),将甲胎蛋白抗体(antiAFP)组装到nanoAus的表面。采用辣根过氧化物酶(HRP)封闭非特异性吸附位点,制得电流型AFP免疫传感器。采用循环伏安、扫描电镜技术研究组装过程及电极性质,探讨了影响免疫传感器性能的因素。在优化实验条件下,电极响应与AFP的浓度在0.01~120 μg/L的范围内呈线性关系,检出限为0.003 μg/L。取临床血清样品用本方法检测AFP含量,得到的结果与临床常用的ELISA法得到的结果无显著性差异。
关键词 聚(3,4乙烯二氧噻吩); 电化学免疫传感器; 甲胎蛋白; 天青Ⅰ
1引言
血清中甲胎蛋白(AFP)的含量是临床用于原发性肝癌和畸胎瘤的早期诊断、疗效观察和愈后判断的重要指标。目前,临床用于AFP检测的方法有酶联免疫吸附法(ELISA)、放射免疫测定法、化学发光法、荧光免疫法等[1,2],但存在灵敏度不高、步骤繁琐或者放射性危害等不足。电流型免疫传感器将电化学检测与ELISA的特点结合,具有灵敏度高、操作简便、干扰少等特点。在电化学免疫分析中,标记抗体的数量直接影响免疫传感器的灵敏度[3~6]。因此, 开发新型的抗体标记材料,增加抗体的负载量,是提高免疫传感器灵敏度的关键。
聚(3,4乙烯二氧噻吩)(PEDOT)是一类功能高分子,可直接用做电极功能基质膜[7,8]。天青Ⅰ(Azure Ⅰ)作为一种生物染料,是一种比较活泼的电子转移体 [9,10]。基于以上原理,本实验研究了PEDOTAzure Ⅰ纳米复合物、纳米金(nanoAus)共修饰于铂盘电极表面固定甲胎蛋白抗体(antiAFP)的电流型免疫传感器。该免疫传感器基于PEDOT与Azure Ⅰ的协同效应,促进酶活性中心与电极表面的电子传递;同时,基于静电吸附的原理将带负电荷的nanoAus固定在PEDOT/Azure Ⅰ复合物表面,固定antiAFP;用辣根过氧化物酶(HRP)代替常用的牛血清蛋白(BSA)封闭非特异性吸附位点。由于PEDOT具有疏松多孔的纳米结构,可有效增大电极的比表面积,增加抗体的固载量;同时HRP对H2O2有电催化作用,可扩增电流响应,这种纳米技术增强与酶催化底物信号增强的联用,可实现信号双重放大,制得高灵敏的电化学免疫传感器。
2实验部分
2.1仪器与试剂
CHI 660B电化学工作站(上海辰华仪器公司),S4800 扫描电子显微镜(Hitachi公司)。
EDOT(纯度>97%,Bayer AG)。Azure Ⅰ(Coleman & Bell公司), AFP试剂盒(郑州博赛生物技术研究所),HRP(Sigma公司),H2O2(30%, w/V,上海化学试剂公司)。[Bmim]BF4(>99%,兰州绿色化学与催化中心),氯金酸(Sigma公司)。其它试剂均为分析纯。
nanoAus在100 ℃的温度下还原氯金酸制得[11],电镜结构表征其平均粒径为16 nm。所有溶液均采用超纯水配制。
2.2免疫传感器的制备
铂盘电极(=1 mm)经氧化铝粉末抛光成镜面,超纯水冲洗,然后依次用乙醇和超纯水超声清洗,氮气吹干。清洗好的电极浸入含有0.1 mol/L EDOT的[Bmim]BF4中,+1.25 V (vs Ag wire)的工作电位恒电位电聚合得到蓝色的PEDOT薄膜,用超纯水洗净;取2 μL 5% Azure Ⅰ溶液滴涂于修饰电极表面,晾干后,洗去结合不够稳定的的Azure Ⅰ,浸入nanoAus溶液中浸泡8 h;将该修饰电极置于30 μL 含有0.25 mg/mL antiAFP的0.05 mol/L PBS溶液(pH 7.4)中,于4 ℃放置过夜;用pH 7.4的PBS溶液洗净,浸入含0.4 mg/mL HRP的0.05 mol/L PBS溶液(pH 7.4)中,4 ℃放置4 h。将制备好的电极在4 ℃下保存备用。该免疫传感器的制备过程见图1。
2.3免疫传感器的检测原理及方法
通过对免疫传感器与待测抗原发生特异性结合前后的电流变化值来对抗原进行定量分析。当待测抗原与抗体特异性结合后,生成的免疫复合物阻碍了H2O2靠近酶催化中,响应电流下降,电流下降值会随着抗原浓度的增加而增大。
电化学免疫传感器的检测采用循环伏安法(CV),以免疫电极为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,铂片为对电极。每次实验前通氮气30 min,整个实验过程保持在氮气氛围中。扫描电位为-0.6~0.3 V,扫速为50 mV/s。免疫测定时,将修饰有抗体的工作电极置于不同浓度的抗原溶液中孵育20 min(25 ℃),然后取出,用0.05 mol/L PBS溶液(pH 7.4)洗净,浸入含有2.5 mmol/L H2O2的PBS溶液(0.1 mol/L, pH 6.5)中,进行CV实验。
3结果与讨论
3.1免疫传感器的电化学表征
用CV法研究了电极在不同修饰状态下的电化学行为(图2)。从图2可知,当铂电极表面电聚合修饰一层PEDOT薄膜后,循环伏安电流明显增加(曲线b),说明在离子液体电解液中聚合得到的PEDOT具有良好的电子传递性能[12,13]。当修饰了一层Azure Ⅰ后,电极呈现一对峰形良好的氧化还原峰(曲线c),说明Azure Ⅰ在电极表面形成了很好的导电膜。当nanoAus修饰在电极上后,氧化还原峰电流进一步增大(曲线d),这是由于nanoAus的电子通道作用,有助于电极表面电子的传输。当antiAFP(曲线e)进一步修饰在电极上,由于蛋白的绝缘性,阻碍电子的传输,氧化还原峰电流明显下降。最后,用HRP封闭电极上的活性位点,氧化还原峰电流进一步减小(曲线f)。
3.2免疫传感器的形貌表征
采用扫描电镜(SEM)技术对组装过程进行了形貌表征。图3为不同修饰电极的SEM图。从图3a可见,离子液体中聚合得到的PEDOT具有疏松多孔的网状结构。这是由于离子液体较高的粘度,降低了单体的扩散速率,从而有助于形成多层的多孔网状结构[14]。该材料具有较大的比表面积,可有效增加电极的比表面积,提高电活性物质Azure Ⅰ和antiAFP的固载量,加快电活性物质与电极之间的电子传递,提高免疫传感器的灵敏度。经AzureⅠ修饰后,整个表面交联形成一个比较致密的网状结构(图3b)。当nanoAus修饰到电极表面,可以观察到表面覆盖了一层粒径为10Symbolm@@ 8 m的颗粒(图3c)。 antiAFP被吸附到修饰电极上时由于蛋白的绝缘性,其表面变得模糊,表明antiAFP已成功修饰到电极表面(图3d)。
3.3免疫传感器的催化特性
修饰在电极表面的HRP具有两方面作用,一是封闭电极表面未被占据的活性点,避免非特异性反应;二是基于HRP对H2O2的催化作用来放大免疫反应信号。图4a为修饰电极在pH 6.5的PBS中添加以及未添加H2O2的CV图。当溶液中不含有H2O2时,曲线2出现一对Azure Ⅰ的氧化还原峰;当加入2.5 mmol/L H2O2后(曲线1),氧化电流减小,还原峰电流从2.3 μA增加到3.7 μA,说明采用HRP代替BSA封闭活性位点的同时还可以放大电流信号[9]。
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