超氧阴离子自由基电化学分析的新进展
王振+张立敏+田阳
摘要：超氧阴离子自由基（O·-2）是分子氧在生物体内氧化还原反应中产生的活性中间体，其动态变化可以提供丰富的生理、病理信息。因此，实时、在体检测O·-2自由基的分析方法越来越受到人们的关注。电化学分析方法具有直观、简单、易微型化等优点，在O·-2自由基检测中得到了广泛的应用。本文从溶液/电极界面的设计入手，利用酶的直接电子传递，结合O·-2自由基的分析特性，简要评述了近几年电化学分析在细胞和活体内O·-2自由基检测方面的研究进展。
关键词：超氧阴离子自由基； 活体； 电化学分析； 直接电子传递； 酶； 综述
1引言
作为新陈代谢的活性中间体，正常状态下O·-2自由基在生物体中保持相对稳定的动态平衡。细胞自身的细胞色素c（Cytochrome c， Cyt. c）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase， SOD）等具有抗氧化能力，可以将O·-2自由基转化为无害物质进行自我修复，这一系列的过程对细胞增殖、凋亡、损伤具有重要的影响，并在细胞信号转导过程中起着十分重要的作用。当细胞受到外界刺激或发生病变过程中会产生过量O·-2自由基，使得细胞产生氧化应激，引起癌症、神经性疾病、帕金森病等生理病变[1～5]，从而对细胞的生理和病理功能产生重要的影响。因此，检测生物体中O·-2自由基的浓度具有十分重要的现实意义。
然而，因为O·-2自由基具有氧化活性高、体内浓度低、寿命短等特点，所以需要发展原位、实时、活体的O·-2自由基检测方法。电化学方法具有操作简单、易微型化、灵敏度高、易于原位、实时、在体检测等优点而备受关注，其中，基于酶传感器的电化学分析方法最为引人注目[6～11]。2溶液/电极界面的设计及酶的直接电子传递
2.1溶液/电极界面的设计
针对O·-2自由基的电化学分析，对溶液/电极界面进行设计以改善和提高电极的分析性能是一个极其关键的问题[12～16]。酶自身体积较大，而活性中心通常都深埋在其内部，从而加大了活性中心到电极表面的电子传递距离，不利于实现直接电子传递。第二代酶传感器采用氧化还原电子媒介体在酶的氧化还原活性中心与电极之间传递电子，但存在媒介体的流失和干扰大的缺陷，给O·-2自由基的准确测定带来干扰，从而极大限制了其实际应用。第三代酶传感器的开发使这个领域向前迈进了一大步。通过界面设计优化，利用酶的直接电子传递机理克服了原先的不足，能够实现细胞或生物体中O·-2自由基的直接检测。界面设计优化是人为地设计电极表面微结构和其界面反应，通过将酶固定在电极表面上，使暴露的电活性中心更接近电极表面，实现酶与电极之间快速的电子传递，达到预期检测的目标。
2.1.1分子设计分子自组装是对固体表面进行修饰最为有效的手段之一。高度有序、结构可控、定向密集的稳定分子层为保持酶蛋白质的天然结构和构象提供理想的微环境。同时，单分子作为加快电子传递的促进剂，可以用于探索电极表面分子微结构和宏观电化学响应之间的关系。巯基化物在金属表面自组装是目前研究得最广泛、最深入的一类物质。其自组装膜有序性强，不易聚合，条件控制容易等优点扩展其在传感方面研究和应用的范围。 Tian等[17]在金电极表面自组装一层巯基半胱氨酸单分子膜来考察溶液中SOD的电化学活性，同时以裸金电极作为对比，实验结果证实SOD能够固定于分子修饰电极的表面上，使得电极反应更容易实现，这可能由于半胱氨酸在界面自发形成的一种热力学稳定分子层，更有利于实现SOD“软着陆”。随后，他们又将3种SOD（Cu， ZnSOD，FeSOD 和MnSOD）分别固定在巯基半胱氨酸修饰的金电极界面上，首次同时实现3种SOD的直接电子传递；巯基半胱氨酸作为促进剂加快电子的传递。通过分子设计在界面上自组装单分子体系考察电子转移过程，为更深层次的分子设计和功能组装反馈信息[18]。
此外，作为一种常用的选择性结合组氨酸标记蛋白质的方式，次氮基三乙酸/组氨酸（NTA/HT）技术成为组氨酸结合最成功的模版。其将蛋白质定向有序固定在电极表面上，并加快电子传递。Jolnson等[19]利用该通用模版技术成功将蛋白质固定在金电极表面上，通过大环效应使NTA衍生物的三氮杂环与金属离子稳定反应，使得该体系具有更高的稳定性。
摘要：超氧阴离子自由基（O·-2）是分子氧在生物体内氧化还原反应中产生的活性中间体，其动态变化可以提供丰富的生理、病理信息。因此，实时、在体检测O·-2自由基的分析方法越来越受到人们的关注。电化学分析方法具有直观、简单、易微型化等优点，在O·-2自由基检测中得到了广泛的应用。本文从溶液/电极界面的设计入手，利用酶的直接电子传递，结合O·-2自由基的分析特性，简要评述了近几年电化学分析在细胞和活体内O·-2自由基检测方面的研究进展。
关键词：超氧阴离子自由基； 活体； 电化学分析； 直接电子传递； 酶； 综述
1引言
作为新陈代谢的活性中间体，正常状态下O·-2自由基在生物体中保持相对稳定的动态平衡。细胞自身的细胞色素c（Cytochrome c， Cyt. c）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase， SOD）等具有抗氧化能力，可以将O·-2自由基转化为无害物质进行自我修复，这一系列的过程对细胞增殖、凋亡、损伤具有重要的影响，并在细胞信号转导过程中起着十分重要的作用。当细胞受到外界刺激或发生病变过程中会产生过量O·-2自由基，使得细胞产生氧化应激，引起癌症、神经性疾病、帕金森病等生理病变[1～5]，从而对细胞的生理和病理功能产生重要的影响。因此，检测生物体中O·-2自由基的浓度具有十分重要的现实意义。
然而，因为O·-2自由基具有氧化活性高、体内浓度低、寿命短等特点，所以需要发展原位、实时、活体的O·-2自由基检测方法。电化学方法具有操作简单、易微型化、灵敏度高、易于原位、实时、在体检测等优点而备受关注，其中，基于酶传感器的电化学分析方法最为引人注目[6～11]。2溶液/电极界面的设计及酶的直接电子传递
2.1溶液/电极界面的设计
针对O·-2自由基的电化学分析，对溶液/电极界面进行设计以改善和提高电极的分析性能是一个极其关键的问题[12～16]。酶自身体积较大，而活性中心通常都深埋在其内部，从而加大了活性中心到电极表面的电子传递距离，不利于实现直接电子传递。第二代酶传感器采用氧化还原电子媒介体在酶的氧化还原活性中心与电极之间传递电子，但存在媒介体的流失和干扰大的缺陷，给O·-2自由基的准确测定带来干扰，从而极大限制了其实际应用。第三代酶传感器的开发使这个领域向前迈进了一大步。通过界面设计优化，利用酶的直接电子传递机理克服了原先的不足，能够实现细胞或生物体中O·-2自由基的直接检测。界面设计优化是人为地设计电极表面微结构和其界面反应，通过将酶固定在电极表面上，使暴露的电活性中心更接近电极表面，实现酶与电极之间快速的电子传递，达到预期检测的目标。
2.1.1分子设计分子自组装是对固体表面进行修饰最为有效的手段之一。高度有序、结构可控、定向密集的稳定分子层为保持酶蛋白质的天然结构和构象提供理想的微环境。同时，单分子作为加快电子传递的促进剂，可以用于探索电极表面分子微结构和宏观电化学响应之间的关系。巯基化物在金属表面自组装是目前研究得最广泛、最深入的一类物质。其自组装膜有序性强，不易聚合，条件控制容易等优点扩展其在传感方面研究和应用的范围。 Tian等[17]在金电极表面自组装一层巯基半胱氨酸单分子膜来考察溶液中SOD的电化学活性，同时以裸金电极作为对比，实验结果证实SOD能够固定于分子修饰电极的表面上，使得电极反应更容易实现，这可能由于半胱氨酸在界面自发形成的一种热力学稳定分子层，更有利于实现SOD“软着陆”。随后，他们又将3种SOD（Cu， ZnSOD，FeSOD 和MnSOD）分别固定在巯基半胱氨酸修饰的金电极界面上，首次同时实现3种SOD的直接电子传递；巯基半胱氨酸作为促进剂加快电子的传递。通过分子设计在界面上自组装单分子体系考察电子转移过程，为更深层次的分子设计和功能组装反馈信息[18]。
此外，作为一种常用的选择性结合组氨酸标记蛋白质的方式，次氮基三乙酸/组氨酸（NTA/HT）技术成为组氨酸结合最成功的模版。其将蛋白质定向有序固定在电极表面上，并加快电子传递。Jolnson等[19]利用该通用模版技术成功将蛋白质固定在金电极表面上，通过大环效应使NTA衍生物的三氮杂环与金属离子稳定反应，使得该体系具有更高的稳定性。
摘要：超氧阴离子自由基（O·-2）是分子氧在生物体内氧化还原反应中产生的活性中间体，其动态变化可以提供丰富的生理、病理信息。因此，实时、在体检测O·-2自由基的分析方法越来越受到人们的关注。电化学分析方法具有直观、简单、易微型化等优点，在O·-2自由基检测中得到了广泛的应用。本文从溶液/电极界面的设计入手，利用酶的直接电子传递，结合O·-2自由基的分析特性，简要评述了近几年电化学分析在细胞和活体内O·-2自由基检测方面的研究进展。
关键词：超氧阴离子自由基； 活体； 电化学分析； 直接电子传递； 酶； 综述
1引言
作为新陈代谢的活性中间体，正常状态下O·-2自由基在生物体中保持相对稳定的动态平衡。细胞自身的细胞色素c（Cytochrome c， Cyt. c）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase， SOD）等具有抗氧化能力，可以将O·-2自由基转化为无害物质进行自我修复，这一系列的过程对细胞增殖、凋亡、损伤具有重要的影响，并在细胞信号转导过程中起着十分重要的作用。当细胞受到外界刺激或发生病变过程中会产生过量O·-2自由基，使得细胞产生氧化应激，引起癌症、神经性疾病、帕金森病等生理病变[1～5]，从而对细胞的生理和病理功能产生重要的影响。因此，检测生物体中O·-2自由基的浓度具有十分重要的现实意义。
然而，因为O·-2自由基具有氧化活性高、体内浓度低、寿命短等特点，所以需要发展原位、实时、活体的O·-2自由基检测方法。电化学方法具有操作简单、易微型化、灵敏度高、易于原位、实时、在体检测等优点而备受关注，其中，基于酶传感器的电化学分析方法最为引人注目[6～11]。2溶液/电极界面的设计及酶的直接电子传递
2.1溶液/电极界面的设计
针对O·-2自由基的电化学分析，对溶液/电极界面进行设计以改善和提高电极的分析性能是一个极其关键的问题[12～16]。酶自身体积较大，而活性中心通常都深埋在其内部，从而加大了活性中心到电极表面的电子传递距离，不利于实现直接电子传递。第二代酶传感器采用氧化还原电子媒介体在酶的氧化还原活性中心与电极之间传递电子，但存在媒介体的流失和干扰大的缺陷，给O·-2自由基的准确测定带来干扰，从而极大限制了其实际应用。第三代酶传感器的开发使这个领域向前迈进了一大步。通过界面设计优化，利用酶的直接电子传递机理克服了原先的不足，能够实现细胞或生物体中O·-2自由基的直接检测。界面设计优化是人为地设计电极表面微结构和其界面反应，通过将酶固定在电极表面上，使暴露的电活性中心更接近电极表面，实现酶与电极之间快速的电子传递，达到预期检测的目标。
2.1.1分子设计分子自组装是对固体表面进行修饰最为有效的手段之一。高度有序、结构可控、定向密集的稳定分子层为保持酶蛋白质的天然结构和构象提供理想的微环境。同时，单分子作为加快电子传递的促进剂，可以用于探索电极表面分子微结构和宏观电化学响应之间的关系。巯基化物在金属表面自组装是目前研究得最广泛、最深入的一类物质。其自组装膜有序性强，不易聚合，条件控制容易等优点扩展其在传感方面研究和应用的范围。 Tian等[17]在金电极表面自组装一层巯基半胱氨酸单分子膜来考察溶液中SOD的电化学活性，同时以裸金电极作为对比，实验结果证实SOD能够固定于分子修饰电极的表面上，使得电极反应更容易实现，这可能由于半胱氨酸在界面自发形成的一种热力学稳定分子层，更有利于实现SOD“软着陆”。随后，他们又将3种SOD（Cu， ZnSOD，FeSOD 和MnSOD）分别固定在巯基半胱氨酸修饰的金电极界面上，首次同时实现3种SOD的直接电子传递；巯基半胱氨酸作为促进剂加快电子的传递。通过分子设计在界面上自组装单分子体系考察电子转移过程，为更深层次的分子设计和功能组装反馈信息[18]。
此外，作为一种常用的选择性结合组氨酸标记蛋白质的方式，次氮基三乙酸/组氨酸（NTA/HT）技术成为组氨酸结合最成功的模版。其将蛋白质定向有序固定在电极表面上，并加快电子传递。Jolnson等[19]利用该通用模版技术成功将蛋白质固定在金电极表面上，通过大环效应使NTA衍生物的三氮杂环与金属离子稳定反应，使得该体系具有更高的稳定性。
摘要：超氧阴离子自由基（O·-2）是分子氧在生物体内氧化还原反应中产生的活性中间体，其动态变化可以提供丰富的生理、病理信息。因此，实时、在体检测O·-2自由基的分析方法越来越受到人们的关注。电化学分析方法具有直观、简单、易微型化等优点，在O·-2自由基检测中得到了广泛的应用。本文从溶液/电极界面的设计入手，利用酶的直接电子传递，结合O·-2自由基的分析特性，简要评述了近几年电化学分析在细胞和活体内O·-2自由基检测方面的研究进展。
关键词：超氧阴离子自由基； 活体； 电化学分析； 直接电子传递； 酶； 综述
1引言
作为新陈代谢的活性中间体，正常状态下O·-2自由基在生物体中保持相对稳定的动态平衡。细胞自身的细胞色素c（Cytochrome c， Cyt. c）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase， SOD）等具有抗氧化能力，可以将O·-2自由基转化为无害物质进行自我修复，这一系列的过程对细胞增殖、凋亡、损伤具有重要的影响，并在细胞信号转导过程中起着十分重要的作用。当细胞受到外界刺激或发生病变过程中会产生过量O·-2自由基，使得细胞产生氧化应激，引起癌症、神经性疾病、帕金森病等生理病变[1～5]，从而对细胞的生理和病理功能产生重要的影响。因此，检测生物体中O·-2自由基的浓度具有十分重要的现实意义。
然而，因为O·-2自由基具有氧化活性高、体内浓度低、寿命短等特点，所以需要发展原位、实时、活体的O·-2自由基检测方法。电化学方法具有操作简单、易微型化、灵敏度高、易于原位、实时、在体检测等优点而备受关注，其中，基于酶传感器的电化学分析方法最为引人注目[6～11]。2溶液/电极界面的设计及酶的直接电子传递
2.1溶液/电极界面的设计
针对O·-2自由基的电化学分析，对溶液/电极界面进行设计以改善和提高电极的分析性能是一个极其关键的问题[12～16]。酶自身体积较大，而活性中心通常都深埋在其内部，从而加大了活性中心到电极表面的电子传递距离，不利于实现直接电子传递。第二代酶传感器采用氧化还原电子媒介体在酶的氧化还原活性中心与电极之间传递电子，但存在媒介体的流失和干扰大的缺陷，给O·-2自由基的准确测定带来干扰，从而极大限制了其实际应用。第三代酶传感器的开发使这个领域向前迈进了一大步。通过界面设计优化，利用酶的直接电子传递机理克服了原先的不足，能够实现细胞或生物体中O·-2自由基的直接检测。界面设计优化是人为地设计电极表面微结构和其界面反应，通过将酶固定在电极表面上，使暴露的电活性中心更接近电极表面，实现酶与电极之间快速的电子传递，达到预期检测的目标。
2.1.1分子设计分子自组装是对固体表面进行修饰最为有效的手段之一。高度有序、结构可控、定向密集的稳定分子层为保持酶蛋白质的天然结构和构象提供理想的微环境。同时，单分子作为加快电子传递的促进剂，可以用于探索电极表面分子微结构和宏观电化学响应之间的关系。巯基化物在金属表面自组装是目前研究得最广泛、最深入的一类物质。其自组装膜有序性强，不易聚合，条件控制容易等优点扩展其在传感方面研究和应用的范围。 Tian等[17]在金电极表面自组装一层巯基半胱氨酸单分子膜来考察溶液中SOD的电化学活性，同时以裸金电极作为对比，实验结果证实SOD能够固定于分子修饰电极的表面上，使得电极反应更容易实现，这可能由于半胱氨酸在界面自发形成的一种热力学稳定分子层，更有利于实现SOD“软着陆”。随后，他们又将3种SOD（Cu， ZnSOD，FeSOD 和MnSOD）分别固定在巯基半胱氨酸修饰的金电极界面上，首次同时实现3种SOD的直接电子传递；巯基半胱氨酸作为促进剂加快电子的传递。通过分子设计在界面上自组装单分子体系考察电子转移过程，为更深层次的分子设计和功能组装反馈信息[18]。
此外，作为一种常用的选择性结合组氨酸标记蛋白质的方式，次氮基三乙酸/组氨酸（NTA/HT）技术成为组氨酸结合最成功的模版。其将蛋白质定向有序固定在电极表面上，并加快电子传递。Jolnson等[19]利用该通用模版技术成功将蛋白质固定在金电极表面上，通过大环效应使NTA衍生物的三氮杂环与金属离子稳定反应，使得该体系具有更高的稳定性。
摘要：超氧阴离子自由基（O·-2）是分子氧在生物体内氧化还原反应中产生的活性中间体，其动态变化可以提供丰富的生理、病理信息。因此，实时、在体检测O·-2自由基的分析方法越来越受到人们的关注。电化学分析方法具有直观、简单、易微型化等优点，在O·-2自由基检测中得到了广泛的应用。本文从溶液/电极界面的设计入手，利用酶的直接电子传递，结合O·-2自由基的分析特性，简要评述了近几年电化学分析在细胞和活体内O·-2自由基检测方面的研究进展。
关键词：超氧阴离子自由基； 活体； 电化学分析； 直接电子传递； 酶； 综述
1引言
作为新陈代谢的活性中间体，正常状态下O·-2自由基在生物体中保持相对稳定的动态平衡。细胞自身的细胞色素c（Cytochrome c， Cyt. c）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase， SOD）等具有抗氧化能力，可以将O·-2自由基转化为无害物质进行自我修复，这一系列的过程对细胞增殖、凋亡、损伤具有重要的影响，并在细胞信号转导过程中起着十分重要的作用。当细胞受到外界刺激或发生病变过程中会产生过量O·-2自由基，使得细胞产生氧化应激，引起癌症、神经性疾病、帕金森病等生理病变[1～5]，从而对细胞的生理和病理功能产生重要的影响。因此，检测生物体中O·-2自由基的浓度具有十分重要的现实意义。
然而，因为O·-2自由基具有氧化活性高、体内浓度低、寿命短等特点，所以需要发展原位、实时、活体的O·-2自由基检测方法。电化学方法具有操作简单、易微型化、灵敏度高、易于原位、实时、在体检测等优点而备受关注，其中，基于酶传感器的电化学分析方法最为引人注目[6～11]。2溶液/电极界面的设计及酶的直接电子传递
2.1溶液/电极界面的设计
针对O·-2自由基的电化学分析，对溶液/电极界面进行设计以改善和提高电极的分析性能是一个极其关键的问题[12～16]。酶自身体积较大，而活性中心通常都深埋在其内部，从而加大了活性中心到电极表面的电子传递距离，不利于实现直接电子传递。第二代酶传感器采用氧化还原电子媒介体在酶的氧化还原活性中心与电极之间传递电子，但存在媒介体的流失和干扰大的缺陷，给O·-2自由基的准确测定带来干扰，从而极大限制了其实际应用。第三代酶传感器的开发使这个领域向前迈进了一大步。通过界面设计优化，利用酶的直接电子传递机理克服了原先的不足，能够实现细胞或生物体中O·-2自由基的直接检测。界面设计优化是人为地设计电极表面微结构和其界面反应，通过将酶固定在电极表面上，使暴露的电活性中心更接近电极表面，实现酶与电极之间快速的电子传递，达到预期检测的目标。
2.1.1分子设计分子自组装是对固体表面进行修饰最为有效的手段之一。高度有序、结构可控、定向密集的稳定分子层为保持酶蛋白质的天然结构和构象提供理想的微环境。同时，单分子作为加快电子传递的促进剂，可以用于探索电极表面分子微结构和宏观电化学响应之间的关系。巯基化物在金属表面自组装是目前研究得最广泛、最深入的一类物质。其自组装膜有序性强，不易聚合，条件控制容易等优点扩展其在传感方面研究和应用的范围。 Tian等[17]在金电极表面自组装一层巯基半胱氨酸单分子膜来考察溶液中SOD的电化学活性，同时以裸金电极作为对比，实验结果证实SOD能够固定于分子修饰电极的表面上，使得电极反应更容易实现，这可能由于半胱氨酸在界面自发形成的一种热力学稳定分子层，更有利于实现SOD“软着陆”。随后，他们又将3种SOD（Cu， ZnSOD，FeSOD 和MnSOD）分别固定在巯基半胱氨酸修饰的金电极界面上，首次同时实现3种SOD的直接电子传递；巯基半胱氨酸作为促进剂加快电子的传递。通过分子设计在界面上自组装单分子体系考察电子转移过程，为更深层次的分子设计和功能组装反馈信息[18]。
此外，作为一种常用的选择性结合组氨酸标记蛋白质的方式，次氮基三乙酸/组氨酸（NTA/HT）技术成为组氨酸结合最成功的模版。其将蛋白质定向有序固定在电极表面上，并加快电子传递。Jolnson等[19]利用该通用模版技术成功将蛋白质固定在金电极表面上，通过大环效应使NTA衍生物的三氮杂环与金属离子稳定反应，使得该体系具有更高的稳定性。
摘要：超氧阴离子自由基（O·-2）是分子氧在生物体内氧化还原反应中产生的活性中间体，其动态变化可以提供丰富的生理、病理信息。因此，实时、在体检测O·-2自由基的分析方法越来越受到人们的关注。电化学分析方法具有直观、简单、易微型化等优点，在O·-2自由基检测中得到了广泛的应用。本文从溶液/电极界面的设计入手，利用酶的直接电子传递，结合O·-2自由基的分析特性，简要评述了近几年电化学分析在细胞和活体内O·-2自由基检测方面的研究进展。
关键词：超氧阴离子自由基； 活体； 电化学分析； 直接电子传递； 酶； 综述
1引言
作为新陈代谢的活性中间体，正常状态下O·-2自由基在生物体中保持相对稳定的动态平衡。细胞自身的细胞色素c（Cytochrome c， Cyt. c）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase， SOD）等具有抗氧化能力，可以将O·-2自由基转化为无害物质进行自我修复，这一系列的过程对细胞增殖、凋亡、损伤具有重要的影响，并在细胞信号转导过程中起着十分重要的作用。当细胞受到外界刺激或发生病变过程中会产生过量O·-2自由基，使得细胞产生氧化应激，引起癌症、神经性疾病、帕金森病等生理病变[1～5]，从而对细胞的生理和病理功能产生重要的影响。因此，检测生物体中O·-2自由基的浓度具有十分重要的现实意义。
然而，因为O·-2自由基具有氧化活性高、体内浓度低、寿命短等特点，所以需要发展原位、实时、活体的O·-2自由基检测方法。电化学方法具有操作简单、易微型化、灵敏度高、易于原位、实时、在体检测等优点而备受关注，其中，基于酶传感器的电化学分析方法最为引人注目[6～11]。2溶液/电极界面的设计及酶的直接电子传递
2.1溶液/电极界面的设计
针对O·-2自由基的电化学分析，对溶液/电极界面进行设计以改善和提高电极的分析性能是一个极其关键的问题[12～16]。酶自身体积较大，而活性中心通常都深埋在其内部，从而加大了活性中心到电极表面的电子传递距离，不利于实现直接电子传递。第二代酶传感器采用氧化还原电子媒介体在酶的氧化还原活性中心与电极之间传递电子，但存在媒介体的流失和干扰大的缺陷，给O·-2自由基的准确测定带来干扰，从而极大限制了其实际应用。第三代酶传感器的开发使这个领域向前迈进了一大步。通过界面设计优化，利用酶的直接电子传递机理克服了原先的不足，能够实现细胞或生物体中O·-2自由基的直接检测。界面设计优化是人为地设计电极表面微结构和其界面反应，通过将酶固定在电极表面上，使暴露的电活性中心更接近电极表面，实现酶与电极之间快速的电子传递，达到预期检测的目标。
2.1.1分子设计分子自组装是对固体表面进行修饰最为有效的手段之一。高度有序、结构可控、定向密集的稳定分子层为保持酶蛋白质的天然结构和构象提供理想的微环境。同时，单分子作为加快电子传递的促进剂，可以用于探索电极表面分子微结构和宏观电化学响应之间的关系。巯基化物在金属表面自组装是目前研究得最广泛、最深入的一类物质。其自组装膜有序性强，不易聚合，条件控制容易等优点扩展其在传感方面研究和应用的范围。 Tian等[17]在金电极表面自组装一层巯基半胱氨酸单分子膜来考察溶液中SOD的电化学活性，同时以裸金电极作为对比，实验结果证实SOD能够固定于分子修饰电极的表面上，使得电极反应更容易实现，这可能由于半胱氨酸在界面自发形成的一种热力学稳定分子层，更有利于实现SOD“软着陆”。随后，他们又将3种SOD（Cu， ZnSOD，FeSOD 和MnSOD）分别固定在巯基半胱氨酸修饰的金电极界面上，首次同时实现3种SOD的直接电子传递；巯基半胱氨酸作为促进剂加快电子的传递。通过分子设计在界面上自组装单分子体系考察电子转移过程，为更深层次的分子设计和功能组装反馈信息[18]。
此外，作为一种常用的选择性结合组氨酸标记蛋白质的方式，次氮基三乙酸/组氨酸（NTA/HT）技术成为组氨酸结合最成功的模版。其将蛋白质定向有序固定在电极表面上，并加快电子传递。Jolnson等[19]利用该通用模版技术成功将蛋白质固定在金电极表面上，通过大环效应使NTA衍生物的三氮杂环与金属离子稳定反应，使得该体系具有更高的稳定性。
