异泽兰黄素通过PDGFβ/ERK信号通路抑制增生性瘢痕生长的机制探讨
吴志贤 李响 莫自增
[摘要]目的：探討异泽兰黄素（Eupatilin）介导PDGFβ对增生性瘢痕成纤维细胞增殖抑制作用的分子机制。方法：应用组织贴壁法从增生性瘢痕和正常皮肤组织中分离增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞，Western blot法检测PDGFβ在增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞中的表达，通过脂质体转染pcDNA3.1-PDGFβ构建PDGFβ过表达增生性瘢痕成纤维细胞，CCK8法检测过表达PDGFβ对异泽兰黄素抑制增生性瘢痕成纤维细胞活力的影响，流式细胞仪检测过表达PDGFβ对异泽兰黄素促进增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的影响，Western blot法检测过表达PDGFβ对异泽兰黄素调控细胞内p-ERK、Bcl2和Bax蛋白表达的影响。结果：免疫组化和Western blot结果表明，与正常皮肤组织和成纤维细胞比较，增生性瘢痕组织和成纤维细胞中PDGFβ高表达;CCK8结果显示，与空载对照组（pcDNA31-control）比较，PDGFβ过表达组瘢痕成纤维细胞活力显著升高（P<0.05）;流式细胞术检测结果表明，与对照组pcDNA3.1-control+Eupatilin比较，pcDNA3.1-PDGFβ+Eupatilin组增生性瘢痕成纤维细胞凋亡率显著降低（P<0.05）;Western blot结果显示，PDGFβ过表达能显著促进p-ERK和Bcl2的表达增加，抑制Bax蛋白表达（P<0.05），与对照组相比具有显著统计学差异。结论：异泽兰黄素可抑制增生性瘢痕PDGFβ蛋白的表达，通过抑制PDGFβ/ERK通路诱导细胞凋亡。
[关键词]异泽兰黄素;增生性瘢痕;细胞凋亡;PDGFβ;ERK通路
[中图分类号]R619+.6 ? ?[文献标志码]A ? ?[文章编号]1008-6455（2019）07-0044-04
Eupatilin Inhibits Hypertrophic Scar Proliferation Via the PDGFβ/ERK Signaling Pathway
WU Zhi-xian， LI Xiang，MO Zi-zeng，LIANG Jie
（Department of Plastic Surgery，Affiliated Hospital of Guangdong Medical University，Zhanjiang 524001，Guangdong，China）
Abstract： Objective ?To investigate the molecular mechanism of Eupatilin-mediated PDGFβ inhibiting the proliferation of hypertrophic scar fibroblasts. Methods ?The hypertrophic scars and normal skin fibroblasts were separated from hypertrophic scars and normal skin tissue by tissue adherence. The expression of PDGFβ in hypertrophic scars and normal skin fibroblasts were examined by western blot. The effect of PDGFβ on the viability of hypertrophic scar fibroblasts inhibited by Eupatilin was evaluated by CCK8 assay. The effect of PDGFβ on the apoptosis of hypertrophic scar fibroblasts induced by Eupatilin was measured by flow cytometry analysis. The effect of PDGFβ on the expression of ERK， p-ERK， Bcl2 and Bax were examined by western blot analysis. Results ? Immunohistochemistry and western blot results showed that PDGFβ was highly expressed in hypertrophic scar tissue and fibroblasts compared with normal skin tissue and fibroblasts. CCK8 results showed that the activity of scar fibroblasts in the PDGFβ overexpression group was significantly higher compared with the empty control group （pcDNA31-control） （P<0.05）. Flow cytometry results showed that the apoptosis rate of the hypertrophic scar fibroblasts in the pcDNA3.1-PDGFβ+Eupatilin group was significantly lower compared with the control group pcDNA3.1-control+Eupatilin （P<0.05）. Western blot results showed that overexpression of PDGFβ significantly promoted the expression of p-ERK and Bcl2 and inhibited the expression of Bax protein， which was significantly different from the control group （P<0.05）. Conclusion ?Eupatilin inhibits the expression of PDGFβ protein in hypertrophic scars and induces apoptosis by inhibiting PDGFβ/ERK pathway.
Key words： eupatilin; hypertrophic scar; apoptosis; PDGFβ; ERK signaling pathway
正常皮肤损伤后，创伤后组织修复异常导致增生性瘢痕的产生。增生性瘢痕不仅伴有瘙痒等并发症，而且严重影响美观，给患者带来巨大压力。增生性瘢痕主要表现为多种纤维化因子的过度表达，胶原蛋白等细胞外基质过度合成和降解减少[1]。由于增生性瘢痕发病机制尚未完全阐明，对该病的有效预防和治疗一直是整形外科迫于解决的难题。阐明增生性瘢痕的分子发病机理，针对其发病的特异性环节研究和开发治疗增生性瘢痕的新药已经迫切需要[2]。
异泽兰黄素（Eupatilin）分子式为C18H16O7，是中药艾叶里面发现的一种重要的黄酮类活性成分[3]。本课题前期研究表明异泽兰黄素对瘢痕成纤维细胞有抑制作用，但具体分子机制还不清楚[4]。本研究探讨PDGFβ和ERK通路在异泽兰黄素促进增生性瘢痕成纤维细胞凋亡中的作用，进一步阐明其抑制增生性瘢痕成纤维细胞生长的分子机制，为增生性瘢痕的治疗提供临床应用依据。
1 ?材料和方法
1.1 试验试剂和仪器：异泽兰黄素（美国sigma公司）;pcDNA3.1-PDGFβ及对照载体（上海吉凯基因）;Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（杭州联科生物技术股份有限公司）;ERK、p-ERK、PDGFβ抗体（美国CST公司）;HRP标记羊抗兔IgG、CCK8试剂盒（中国碧云天生物技术）;SABC免疫组化试剂盒（武汉博士德生物）;流式细胞仪（FACSCantoⅡ，美国BD）;多功能凝胶成像系统、多功能酶标仪（美国Bio-Rad公司）。
1.2 试验材料：标本均取自于2017年广东医科大学附属医院整形外科门诊及住院患者手术切下的增生性瘢痕组织及正常的皮肤组织，增生性瘢痕及正常的皮肤组织临床标本各7例，患者年龄20～46岁，平均年龄29岁，其中男4例，女3例，4例来源于耳廓瘢痕，3例来源于背部、胸部等躯干部位瘢痕。所有患者均无其他全身器质性病变，在手术切除前未接受过其他治疗。所有标本均根据临床和病理（ HE染色切片的组织学检查） 诊断证实。标本取材经医学伦理委员会的论证许可，并得到患者知情同意。
1.3 方法
1.3.1 成纤维细胞分离培养：采用组织块培养法进行成纤维细胞原代培养，操作如下：手术切除增生性瘢痕组织和正常皮肤组织（无菌操作），切成1mm×1mm，分散置于细胞培养瓶中，添加RPMI-1640细胞培养液，待成纤维细胞长出并融合成片时进行传代，即为增生性瘢痕成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞。实验用传至3～6代的成纤维细胞。
1.3.2 细胞培养与细胞转染：将原代分离的人正常皮肤成纤维细胞和增生性瘢痕成纤维细胞单层接种在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，37℃、5% CO2培养箱中培养，细胞贴壁生长，常规换液、当细胞密度汇合至90%～95%时，0.25%胰酶消化传代培养。
用不含抗生素的RPMI-1640完全培养基培养瘢痕成纤维细胞，按照Lipofectamine 2000操作说明按比例分别将Lipofectamine 2000和pcDNA3.1-PDGFβ（pcDNA3.1-control对照）混合后加入，6h后去除6孔板内培养基，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基。37℃、5% CO2正常培养后用于后续实验检测。
1.3.3 免疫组化染色检测PDGFβ表达：取人增生性瘢痕组织和人正常皮肤组织的石蜡切片，常规脱蜡复水，按照免疫组化SABC试剂盒操作进行染色，一抗为抗兔PDGFβ，加入DAB显色后封片，于显微镜下镜检拍照。
1.3.4 CCK8检测细胞增殖：取过表达PDGFβ的增生性瘢痕成纤维细胞，0.25%胰酶消化离心，调整细胞浓度为2.5×104个/ml，均以100μl/孔种植于96孔板中，37℃、5% CO2培养箱中培养，24h后加入不同终浓度（0、2.5、5、10、20、40μg/ml）的异泽兰黄素，每组设置3个复孔，置于培养箱中继续培养24h，每孔加入10μl CCK8溶液培养2h，于酶标仪450nm下测定各孔吸光值（A450）。
1.3.5 流式检测细胞凋亡：为了探索异泽兰黄素对增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的影响与PDGFβ之间的关系，通过流式细胞仪检测异泽兰黄素对过表达PDGFβ的增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的影响。取过表达PDGFβ的增生性瘢痕成纤维细胞（空载对照），0.25%胰酶消化离心，调整细胞浓度为2.5×104个/孔种植于6孔板，培养24h后加入终浓度为10μg/ml的异泽兰黄素后培养24h。通过Annexin V-APC/7AAD双染法检测异泽兰黄素对增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的影响，按照试剂盒操作说明书，以Buffer重悬细胞，加入APC标记的工作液和7AAD标记的工作液，冰上孵育15min后立即用流式细胞仪进行检测。
1.3.6 Western blot检测蛋白表达：取过表达PDGFβ的增生性瘢痕成纤维细胞（空载对照），0.25%胰酶消化离心，调整细胞浓度为2.5×104个/孔种植于6孔板，培养24h后加入终浓度为10μg/ml的异泽兰黄素后培养24h，PBS洗涤后加入细胞裂解液裂解细胞，离心后取上清液即为蛋白样品。使用BCA蛋白测定试剂盒对上清液的总蛋白进行蛋白定量，从每个样品中取总蛋白（30μg）加入电泳上样缓冲液，100℃煮沸5min后于12% SDS-PAGE电泳分离蛋白质，电泳后将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室溫封闭1h，加入1：300稀释的一抗，4℃孵育过夜。第2天用TBST洗膜3次，每次5min，加入1：5 000稀释的HRP标记的II抗，室温孵育1h，TBST洗膜6次，每次5min，加入ECL化学发光液显色，用Bio-rad凝胶成像系统拍照，用ImageJ2x软件进行灰度值分析。
1.4 統计学分析：实验至少重复3次，采用SPSS 20.0软件对实验数据进行分析，数据以均数±标准差（x?±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析（One-Way-ANOVA）。P<0.05为差异有统计学意义。
2 ?结果
2.1 PDGFβ在增生性瘢痕组织中高表达：免疫组化结果显示，在正常皮肤组织中PDGFβ呈阴性表达，增生性瘢痕组织中PDGFβ呈阳性表达。见图1。
2.2 PDGFβ在增生性瘢痕成纤维细胞中高表达：Western blot结果显示，与正常皮肤成纤维细胞相比，增生性瘢痕成纤维细胞中PDGFβ的蛋白表达显著升高。见图2。
2.3 异泽兰黄素介导PDGFβ抑制增生性瘢痕成纤维细胞活力：Western blot结果显示，与正常对照组（0μg/ml）相比，异泽兰黄素5、10、20μg/ml组PDGFβ蛋白表达显著降低（P<0.05）（见图3A）。CCK8结果显示，异泽兰黄素5、10、20μg/ml组与正常对照组（0μg/ml）相比，具有显著性差异（P<0.05）。与空载对照组（pcDNA31-control）比较，PDGFβ过表达组瘢痕成纤维细胞活力显著升高（P<0.05）（见图3B）。
2.4 异泽兰黄素介导PDGFβ促进增生性瘢痕成纤维细胞凋亡：流式细胞术检测结果表明，与对照组pcDNA3.1-control+Eupatilin比较，pcDNA3.1-PDGFβ+Eupatilin组增生性瘢痕成纤维细胞凋亡率显著降低 （P<0.05）。见图4。
2.5 异泽兰黄素诱导增生性瘢痕成纤维细胞PDGFβ/ERK通路的活化：免疫印迹检测结果表明，异泽兰黄素组PDGFβ、p-ERK和 Bcl2的蛋白水平显著降低，Bax蛋白表达显著升高;与空载组比较，PDGFβ过表达组p-ERK和Bcl2的表达增加，Bax蛋白表达显著降低（P<0.05）。见图5。
3 ?讨论
增生性瘢痕是皮肤创伤后引发的以成纤维细胞异常增殖并分泌大量细胞外基质为主要特征的一种皮肤纤维化疾病，治疗效果不佳，复发率较高，发病机制尚不清楚[5]。增生性瘢痕虽是一种良性皮肤肿瘤，但无自愈倾向，增生性瘢痕往往不断侵蚀周围正常皮肤，经久不愈、反复感染者有癌变倾向[6]。本课题前期研究表明异泽兰黄素能够促进增生性瘢痕成纤维细胞的凋亡，但对异泽兰黄素抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖的具体分子机制还缺乏研究，本研究构建了PDGFβ过表达瘢痕成纤维细胞，阐明了PDGFβ在异泽兰黄素抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖中的作用。
本研究通过CCK8检测发现，过表达PDGFβ能够抑制异泽兰黄素对增生性瘢痕成纤维细胞活力的抑制作用，流式细胞术检测细胞凋亡结果表明，过表达PDGFβ能够显著抑制异泽兰黄素对增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的促进作用，提示异泽兰黄素可能通过抑制PDGFβ的表达，调控增生性瘢痕成纤维细胞的增殖和凋亡。
PDGF是由α亚基和β亚基组成的一种二聚体糖蛋白，是一种调节细胞增殖和分裂的细胞生长因子。PDGF尤其在血管形成和间充质细胞的有丝分裂方面发挥重要作用[7]。PDGF通过与其受体PDGFR作用，激活信号通路的转导[8-9]。本课题前期研究表明，PDGF在增生性瘢痕中呈阳性表达，并且PDGFβ在增生性瘢痕成纤维细胞中的表达水平显著高于正常皮肤成纤维细胞，表明PDGFβ在增生性瘢痕的发生发展中具有非常重要的作用[10]。ERK（extracellular regulated protein kinases），是细胞外调节蛋白激酶，是促分裂原活化蛋白激酶MAPK家族重要成员之一[11-12]。近年来，国内外大量研究表明，NGF、PDGF和EGF等细胞因子能够激活ERK信号通路，调控细胞的增殖和分裂[13]。PDGF/ERK信号通路是调节细胞增殖和分化的一条重要通路，在肿瘤的增殖和转移中发挥重要作用[14]。
本研究探讨了PDGFβ/ERK在异泽兰黄素诱导细胞凋亡中的作用。异泽兰黄素处理增生性瘢痕成纤维细胞后，PDGFβ、p-ERK和Bcl2的蛋白表达水平明显增加，表明异泽兰黄素能够抑制PDGFβ/ERK通路，而过表达PDGFβ能够抑制瘢痕成纤维细胞凋亡，促进p-ERK和Bcl2的蛋白表达水平，证明异泽兰黄素是通过抑制PDGFβ/ERK通路而诱导增生性瘢痕成纤维细胞凋亡。但异泽兰黄素是如何影响PDGFβ的表达还需要进一步研究来证实。
综上所述，本研究表明异泽兰黄素通过抑制PDGFβ的表达，抑制ERK磷酸化从而抑制PDGFβ/ERK/Bcl2信号通路，继而诱导增生性瘢痕成纤维细胞凋亡，抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖。阐明了异泽兰黄素介导PDGFβ抑制人增生性瘢痕成纤维细胞增殖的分子机制，为临床增生性瘢痕的治疗提供了实验基础。
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[收稿日期]2018-07-26
本文引用格式：吳志贤，李响，莫自增，等.异泽兰黄素通过PDGFβ/ERK
信号通路抑制增生性瘢痕生长的机制探讨[J].中国美容医学，2019，28（7）：44-47.
