C反应球蛋白分析方法的研究进展

    唐铭擎 毛旭华 龚易昕悦 青琳森 谢静

    

    

    

    摘?要?C反应球蛋白（CRP）作为一种重要的急性炎症与感染性疾病相关生物标志物， 临床上常被用于多种疾病的评估与病情监测。目前， CRP的临床检测方法主要有免疫比浊法、酶联免疫吸附比色法和侧向流免疫层析法等。近年来， 随着分析理论和材料学研究的发展， 生物传感技术、微流控技术等新的分析方法与技术不断涌现。本文综述了CRP的分析方法的开发与应用情况， 重点评述了近五年的最新进展， 展望了新型CRP检测方法的研究方向， 以期为开发高灵敏度、高特异性、更能满足临床需求的CRP分析方法提供参考。

    关键词?C反应球蛋白; 诊断; 免疫测定; 生物传感器; 微流控技术; 即时检测; 评述

    1?引 言

    C反应球蛋白（C-reactive protein， CRP）是由5个相同亚基以非共价形式结合而成的五聚体， 是肝细胞合成的急性期蛋白之一[1]。人体CRP水平在机体受到感染或损伤时急剧上升， 因此CRP可作为炎症指标， 辅助诊断炎症相关性疾病[2]。CRP分析方法改进研究也一直是检验医学和生物分析化学领域的热点研究问题。目前， CRP检测以免疫分析为主， 其中应用最广泛的有浊度分析法、酶联免疫吸附法和侧向流免疫層析法等[3]。随着分析理论和材料学研究的发展， 多种学科交叉融合， 逐渐涌现出一些新颖的CRP检测技术， 如生物传感技术、微流控技术和质谱法等。这些新检测技术的出现， 满足了临床CRP检测对高灵敏度、宽检测范围、即时检测与多重生物标志物检测的新需求， 为未来进一步改进CRP分析法提供了新思路。

    2?CRP临床监测意义

    CRP是人体急性时相蛋白（APP）中最灵敏的反应指标， 在正常人体内含量低， 通常低于10 μg/mL[4]。当机体受到感染或组织损伤时， 血内CRP水平可在48 h内迅速上升1000倍[2]。因此CRP可作为明确炎症指标， 辅助诊断新生儿败血症[5]、脓毒血症[6]、代谢疾病[7～9]、荨麻疹[10]、抑郁[11]、肿瘤（除白血病外）[12]等炎症相关性疾病的诊疗工作; 或用于判断呼吸道感染来源， 避免抗生素的滥用[13， 14]。

    手术后患者易感染并发症， 影响血内CRP浓度下调恢复[2]。因此， 常需连续监测患者CRP水平， 用于判断患者手术后是否感染并发症[15～18]。研究发现， CRP能上调血管损伤因子和多种炎症因子水平， 参与早期冠心病与粥动脉样硬化形成机制[19]。近年的研究也证明， CRP浓度上调可用于预测多种心血管疾病发病率[20～23]。

    Ansar等[2]详细综述了血浆CRP浓度与多种疾病发病进程和预后的相关性， 充分体现了CRP分析的临床应用价值。

    3?CRP分析方法概述

    CRP作为存在于血液中的微量蛋白， 受基质干扰大， 通过免疫分析可实现其特异性检测[24]。在识别分子（主要包括CRP特异性抗体、核酸适配体、磷酸酰胆碱、磷酸乙醇胺等）上修饰不同的示踪材料， 当识别分子与样品中CRP的特异性结合后， 示踪材料聚集产生检测信号， 再直接或联用其它检测技术读取检测信号， 实现对样品中CRP的定性或定量分析。本节简要概述了现有CRP分析方法及其分析特点（表1）。

    3.1?经典分析方法及其改进

    经典的CRP分析方法有免疫比浊法（Immunoturbidimetry， ITM）、酶联免疫吸附测定法（Ezyme linked immunosorbent assay， ELISA）和侧向流免疫层析法（Lateral flow assay， LFA）等。

    特异性抗体与靶标抗原结合会形成不溶性免疫复合物， ITM法利用此时体系产生的浊度变化完成样品的定性和定量分析。ITM法一般联用比浊计读取浊度信号， 具备方便快捷、检测范围宽等优点， 是目前临床工作中最常用的CRP检测方法之一。ITM法的主要缺陷在于检测灵敏度低， 为此， 研究者不断地进行了多种方案改进。例如， Yang等[25]将光射流激光技术引入免疫比浊测试， 能有效放大浊度检测信号， 从而增加检测灵敏度。

    ELISA法是通过酶标抗体特异性捕获靶标抗原， 然后利用抗体上的标记酶催化底物显色， 实现样品比色分析。酶标仪配合商业化的ELISA试剂盒是临床实验室CRP测定的主要选择。虽然ELISA法已广泛应用于临床样品检测， 但仍具有操作步骤繁琐、耗时长等缺点， Kim等[26]用毛细管取代传统微孔板作为固相载体， 无需繁琐的试剂添加与洗涤工艺， 即可在30 s内得到显色结果。

    LFA法基于层析原理， 使含有CRP的样品液在纤维素膜毛细力作用下能快速与检测线和质控线上包埋的标记抗体特异性结合， 随后通过检测示踪材料的聚集产生响应信号， 完成样品液检测。LFA分析时间短、操作简便易行， 但经典LFA检测方法检测范围狭窄， 一般只能满足定性检测要求。为增加检测灵敏度、实现定量检测， 研究者通过替换检测性能更强的示踪材料[27～30]、去除抗体比例不合适而导致假阴性的钩状效应（Hook effect）[31，32]等方式， 获得了更宽的检测范围与更低的检出限。

    3.2?生物传感器（Biosensor）

    生物传感器技术是一种将样品中CRP浓度转化为物理化学信号（如电信号、光信号等）的分析技术， 主要利用识别分子捕获CRP， 理化换能器（如场效应管、压电晶体等）转化或放大浓度信号， 实现CRP定量分析。生物传感器技术形式多变， 现已成为建立新型CRP检测方案的主要研究方向之一， 根据检测原理可将其分为电化学生物传感器、光学生物传感器和其它形式的生物传感器等。

    电化学生物传感器（图1A）通过感受检测体系中电信号变化实现样品分析。根据响应信号的不同分为安培型和阻抗型两类。安培型传感器主要观测恒定电压下工作电极的电流变化实现样品分析[33]， 阻抗型传感器则是通过检测电极表面粘附材料的电容、电荷转移电阻或电容变化实现样品分析[34]。相较于安培型传感器， 阻抗型传感器是在小幅正弦电压下进行检测， 对样品蛋白与抗体影响小， 可实现无损检测， 且无需标记， 简单实用。

    光学生物传感器通过感受检测体系中单束或多束光的光学信号变化实现样品分析。目前， CRP光学生物传感器按检测信号不同可分为五类， 分别为基于评估体系颜色变化的比色型传感器[36， 37]、基于评估体系发光信号强度的发光型传感器[38， 39]、基于评估体系反射率变化的反射光谱型传感器[40]、基于评估透射率变化的透射光谱型传感器[41]和基于评估拉曼散射信号变化的表面增强拉曼光谱型（Surface-enhanced Raman spectroscopy， SERS）传感器[35]。其中， SERS是化学和生物医学分析中最为敏感的技术之一（图1B）。将贵金属作为传感器基底， 通过SERS技术放大拉曼信号， 增强检测信号强度， 检出限可降低至5 fg/mL[42]。

    除了上述研究较多的电化学与光学传感器外， 还有基于光热效应[43]、光磁效应[44]、巨磁阻抗效应[45]、压电效应[46]等原理研发的新型CRP生物传感器， 以及联用SERS检测技术与图像编译分析技术的复合式纳米成像传感器等[47，48]。

    3.3?微流控技术（Microfluidics）

    微流控技术是指利用微机电系统， 将样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成于微米级的芯片上， 能自动完成免疫分析全过程的分析检测技术。相较于经典分析方法， 微流控技术不仅对样品需求量小（仅几微升）、操作便捷快速， 还能实现多种生物标志物的同时分析， 是目前临床体外分析技术的主要研究热点。最常见的微流控检测模式， 以Sinha等[49]建立的场效应晶体管微流控技术为代表。在检测芯片上集合多个检测腔室（图2A）， 每个腔室独自完成不同生物标志物的全分析处理过程（图2B）， 具备拓展成为多重指标分析方法的潜力。Chu等[50]用铝镓氮/镓氮作为微流控芯片基底材料， 能屏蔽生物样品中的高电解质影响， 可直接测定人血清中CRP水平。

    3.4?质谱法（Mass spectrometry， MS）

    质谱具备高度灵敏的检测性能， 能识别分子间微小差异， 实现多种生物标志物的同时检测。例如， Gao等[51]将磁珠与抗体偶联使蛋白能快速从样品液中分离， 以氨基酸标记的重组靶蛋白为内标， 基质辅助激光解析串联飞行时间质谱直接分析蛋白质含量， 可同时测定包括CRP在内的4种生物标志物。Ko等[52]结合免疫分析原理， 以不同金属掺杂的纳米颗粒为示踪材料，

    以电感耦合等离子体质谱检测信号， 可间接实现多种生物标志物的同时测定（图3）。

    上述CRP分析方法的特点见表1。总体而言， ITM法检测范围宽， 囊括多种病症， 对应CRP临床检测范围， 适用于临床患者血样的快速定性检测。ELISA法灵敏性好且易判读， 配合使用酶标仪， 可用于临床实验室中CRP的精密测定。LFA法制备成本低， 但检测范围窄， 可用于CRP的定性分析。质谱法检测精密度高， 可实现多重检测模式， 但检测设备对人员素质要求高， 不易普及。

    基于生物传感器与微流控技术的CRP免疫检测方法形式多变， 且操作简单， 能兼顾临床对CRP快速检测需要与高灵敏检测需求。其中， 生物传感器检测灵敏度最高， 检出限可低至5 fg/L[35]， 较适合用于超敏CRP（Hypersensitive C-reactive protein， hs-CRP）的临床分析方法的研发。 微流控技术能自动化实现全分析检测过程， 通过简单设备即可精密读取检测结果， 适用于CRP现场快速检测平台的开发。

    4?CRP分析方法发展趋势

    4.1?提高检测灵敏度

    血浆中仅含有微量CRP， 且血浆中蛋白组成复杂， 除CRP外的无关蛋白（如白蛋白、γ球蛋白等）有可能黏附在检测基底表面， 影响检测基线稳定度。受此影响， 如果CRP分析方法检出限过高， 易造成结果失真， 甚至出现假阳性的现象， 影响临床判断的正确性。因此， 需提高CRP检测灵敏度， 确保CRP含量的准确分析。

    在降低无关蛋白的非特异性吸附方面， Hwang等[55]将一种单晶金纳米片作为SERS检测基底， 利用其原子构成的平坦表面减少无关蛋白的非特异性吸附， 使检测灵敏度提高至10?17 mol/L（图4A）。

    抗体作为识别分子， 其大分子位阻效应和不稳定的理化性质常影响检测灵敏度。核酸适配体作为一种新型识别分子， 是很好的替代选择。Wang等[56]以巯基化核酸适配体代替抗体作为识别分子， 降低了识别分子的空间位阻效应， 增强了理化稳定性， 检出限降低至1.7 pg/mL（图4B）。本研究组[57]也利用核酸适配体作为识别分子， 建立了一种新颖的纳米酶夹心式ELISA法， 检出限可低至8 pg/mL。 O′Reilly等[39]采用小分子抗体作为识别分子， 减少了空间位阻与非特异性吸附， 检出限为0.3 pg/mL。

    此外， 增加检测信号响应， 也可提高检测灵敏度。如Kuo等[58]在电极边缘添加锯齿状结构， 以提高电解质电流强度， 检测灵敏度比传统电极提高了85.81%（图4C）。Wang等[59]利用银介质对拉曼信号的增强作用， 在检测基底表面镀上一层银， 放大检测信号， 使CRP检出限低至0.01 pg/mL（图4D）。

    4.2?扩宽检测范围

    不同病症对应CRP检测范围不同， 实际临床检测要求CRP分析法具有较宽的线性检测范围。LFA法和一些微流控技术检测范围较窄， 只能实现CRP的定性或半定量检测， 无法满足实际临床检测需要。为拓宽检测范围， 研究者进行了多种改进方法的研究。

    采用檢测信号更强的示踪材料， 可以拓宽检测范围。Hu等[27]制备了一种包含多个量子点的荧光纳米球， 将其作为LFA的新示踪材料， 利用其超强荧光信号使检测范围扩宽到0.178～11.4 nmol/L。

    抗体比例不合适而导致假阴性的钩状效应， 被认为是导致免疫分析检测范围窄的重要原因。针对钩状效应对检测范围的限制， Oh等[31]在改进LFA检测方法时， 改变样品垫在试纸条上位置， 控制CRP与捕获抗体和金标抗体间的结合顺序， 减少非特异性结合产生的钩状效应， 将检测范围拓宽至0.119～100 μg/mL（图5A）。Rey等[32]直接更换结果判读指标， 以检测线与质控线检测信号比值变化曲线为浓度判断标准， 成功去除了钩状效应（图5B）。

    在一些分析方法中， 检测基底无法固定识别分子或识别分子负载量过低， 导致检测范围窄。Lee等[60]利用具有高比表面积和丰富的活性官能团的氧化钛纳米纤维垫作为检测基底， 提高了识别抗体的负载量， CRP动态检测范围跨越6个数量级。

    4.3?即时检测

    即时检测（Point of care testing， POCT）是指能在病床旁现场取样， 并通过便携式仪器与配套试剂进行快速分析的方法统称。因不需要复杂样品处理程序和大型仪器， POCT能大大节约检测时间与成本[61]。作为重要的临床生物标志物， CRP的POCT方法开发是临床医学和免疫分析领域极具前景的一个发展方向。

    便携式检测仪器的研发， 可降低检测成本， 简化操作步骤， 满足基层医疗点CRP即时检测需要。Vashist等[62]用手机读取CRP ELISA比色结果， 底部白光投射使检测液颜色分布更均匀， 智能手机摄像头捕捉图像后， 用手机自带的色彩处理软件定量描述图像颜色， 实现比色信号的读取（图6A）。Dong等[63]同样利用手机作为检测仪器， 用其捕捉和分析纳米金聚集产生的颜色信号， 实现CRP即时分析。Ji等[64]通过笔式压力计检测CRP， 以铂纳米粒子作为示踪材料， 压力计读取铂纳米粒子催化过氧化氢产生的氧气压强， 实现CRP检测（图6B）。Lin等[65]用可直接读数的家用血糖仪实现CRP检测：CRP与功能化脂质体结合， 释放包埋其中的淀粉糖苷酶， 使其与Triton X-100直链淀粉反应产生葡萄糖， 血糖仪分析产生的葡糖糖浓度， 间接计算出CRP含量。

    减少繁琐的样品预处理工序与多次洗涤添加过程， 也是POCT的重要研发策略。Joung等[66]利用不对称聚砜膜对流体的延迟释放作用， 研制出可自动化添加二次层析液的LFA检测方案， 可大大精简操作步骤， 满足POCT检测需求。在此基础上， 该研究组利用水膨胀聚合物的吸水膨胀原理开发新型POCT-LFA检测方案[67]， 可更精准控制两次层析液添加间隔时间， 减少检测方案批间差异性（图6C）。Tsai等[68]在研发芯片上增加细胞过滤膜与过滤柱， 可快速去除血细胞和大分子量的无关蛋白， 使该微控流芯片可以不需复杂的样品预处理过程， 即可进行全血检测（图6D）。

    4.4?多重检测

    目前， 单一指标已经无法完全满足临床精准诊断需求， CRP常与其它生物标志物联用， 增加临床诊断准确度。因此， 实现样品的多指标同时检测也是CRP分析的发展方向。

    Qi等[69]在降钙素原和CRP抗体上标记不同量子点， 并设置两条不同的检测线， 开发了可同时检测降钙素原和CRP的LFA（图7A）。Lv等[70]在血清淀粉样蛋白A抗体上标记红色量子点、CRP抗体上标记绿色量子点， 实现双蛋白的同时检测（图7B）。Sinha等[49]研制出一种场效应晶体管微流控芯片， 该芯片有多个检测腔室， 能同时测定包括CRP在内的4种生物标志物， 用于临床心血管疾病发病风险的预测分析。Park等[71]研发的垂直流动检测技术， 能控制液体流动顺序， 避免测试液间互相干扰， 实现多种生物标志物检测。

    5?总结与展望

    CRP作为炎症与感染指标， 可用于多种疾病诊断治疗， 具有重要的临床应用价值。随着材料科学的进步和检测仪器的多样化， 新的CRP分析方法不断涌现， 大大提高了检测灵敏度，大拓宽了检测范围， 满足了POCT与多重检测等临床需求。未来的CRP分析方法研究将重点关注以下3个方面：（1）现今CRP检测方法都是以点时间取样为主， 不适合术后监护等需要长期监测CRP含量的临床工作。因此， 开发一种可在体内实时连续监测CRP的系统可能是未来CRP分析方法的研究热点; （2）生物样品中的无关蛋白易与检测基底或识别抗体产生非特异性吸附， 影响检测结果准确性。为去除非特异性吸附干扰， 检测前需要进行复杂的前处理工作， 不利于临床CRP的快速检测。因此， 建立一种能快速去除或削弱无关蛋白非特异性吸附的检测技术， 有助于同时满足临床快速检测和精准测定需求， 將是未来CRP检测的研究重点; （3）CRP检测的重要价值决定了其必将在基层医疗点被广泛使用。研制低价便携的检测仪器， 降低检测成本， 也是解决CRP分析法无法在资源稀缺地区普及的关键。临床需求决定了CRP分析方法的未来研究方向， 也提示需要继续深入改进CRP分析方法， 尤其需要分析化学、临床医学、材料学、纳米科学、物理学等不同学科之间相互交叉、融合、渗透， 建立以“问题解决”研究为中心的研究方法， 以更好地满足CRP临床检检测需求。

    References

    1?Thompson D， Pepys M B， Wood S P. Structure， 1999， 7（2）： 169-177

    2?Ansar W， Ghosh S. Immunol. Res.， 2013， 56（1）： 131-142

    3?Vashist S K， Venkatesh A G， Marion Schneider E， Beaudoin C， Luppa P B， Luong J H T. Biotechnol. Adv.， 2016， 34（3）： 272-290

    4?Roy N， Ohtani K， Matsuda Y， Mori K， Hwang I， Suzuki Y， Inoue N， Wakamiya N. Biochim. Biophys. Acta， 2016， 1860（6）： 1118-1128

    5?Perrone S， Lotti F， Longini M， Rossetti A， Bindi I， Bazzini F， Belvisi E， Sarnacchiaro P， Scapellato C， Buonocore G. Arch. Dis. Child. Fetal. Neonatal Ed.， 2018， 103（2）： F163-F166

    6?Pierrakos C， Vincent J L. Critical Care， 2010， 14（1）： 1-18

    7?Zoico E， Corzato F， Bambace C， Rossi A P， Micciolo R， Cinti S， Harris T B， Zamboni M. Arch. Gerontol. Geriatr.， 2013， 57（3）： 411-416

    8?Bano G， Trevisan C， Carraro S， Solmi M， Luchini C， Stubbs B， Manzato E， Sergi G， Veronese N. Maturitas， 2017， 96： 10-15

    9?Mc Causland F R， Claggett B， Burdmann E A， Eckardt K U， Kewalramani R， Levey A S， McMurray J J V， Parfrey P， Remuzzi G， Singh A K， Solomon S D， Toto R D， Pfeffer M A. Am. J. Kidney Dis.， 2016，?68（6）： 873-881

    10?Kolkhir P， Altrichter S， Hawro T， Maurer M. Allergy，?2018， 73（4）： 940-948

    11?Misiak B， Stanczykiewicz B， Kotowicz K， Rybakowski J K， Samochowiec J， Frydecka D. Schizophr. Res.， 2018， 192：16-29

    12?Huang J， Baum Y， Alemozaffar M， Ogan K， Harris W， Kucuk O， Master V A. Mol. Aspects Med.， 2015， 45： 28-36

    13?Clark T W， Medina M J， Batham S， Curran M D， Parmar S， Nicholson K G. Eur. Respir. J.， 2015， 45（1）： 76-86

    14?Higdon M M， Le T， O′Brien K L， Murdoch D R， Prosperi C， Baggett H C， Brooks W A， Feikin D R， Hammitt L L， Howie S R C， Kotloff K L， Levine O S， Scott J A G， Thea D M， Awori J O， Baillie V L， Cascio S， Chuananon S， DeLuca A N， Driscoll A J， Ebruke B E， Endtz H P， Kaewpan A， Kahn G， Karani A， Karron R A， Moore D P， Park D E， Rahman M Z， Salaudeen R， Seidenberg P， Somwe S W， Sylla M， Tapia M D， Zeger S L， Deloria Knoll M， Madhi S A. Clin. Infect. Dis.， 2017， 64（suppl 3）： 378-386

    15?Adamina M， Steffen T， Tarantino I， Beutner U， Schmied B M， Warschkow R. Br. J. Surg.， 2015， 102（6）： 590-598

    16?Shishido Y， Fujitani K， Yamamoto K， Hirao M， Tsujinaka T， Sekimoto M. Gastric Cancer，?2016， 19（1）： 293-301

    17?Reynolds I S， Boland M R， Reilly F， Deasy A， Majeed M H， Deasy J， Burke J P， McNamara D A. Colorectal Dis.， 2017， 19（9）： 812-818

    18?Kassir R， Blanc P， Tibalbo L M B， Breton C， Lointier P. Surg. Endosc.， 2015， 29（6）： 1439-1444

    19?Ridker P M. Circ. Res.， 2016， 118（1）： 145-156

    20?Avan A， Sany S B T， Ghayour-Mobarhan M， Rahimi H R， Tajfard M， Ferns G. J. Cell. Physiol.， 2018， 233（11）： 8508-8525

    21?Bielas H， Meister-Langraf R E， Schmid J P， Barth J， Znoj H， Schnyder U， Princip M， von Kanel R. Eur. J. Prev. Cardiol.， 2018， 25（3）： 298-305

    22?Kunutsor S K， Seidu S， Blom A W， Khunti K， Laukkanen J A. Eur. J. Epidemiol.， 2017， 32（8）： 657-667

    23?Kwon C H， Kang J G， Lee H J， Kim N H， Sung J W， Cheong E， Sung K C. Europace， 2017， 19（10）： 1643-1649

    24?Chandra P， Suman P， Airon H， Mukherjee M， Kumar P. World J. Methodol.， 2014， 4（1）： 1-5

    25?Yang X， Shu W X， Wang Y Q， Gong Y， Gong C Y， Chen Q S， Tan X T， Peng G D， Fan X D， Rao Y J. Biosens. Bioelectron.， 2019， 131： 60-66

    26?Kim W J， Cho H Y， Jeong B， Byun S， Huh J， Kim Y J. Sensors， 2017， 18（1）： 55-66

    27?Hu J， Zhang Z L， Wen C Y， Tang M， Wu L L， Liu C， Zhu L， Pang D W. Anal. Chem.， 2016， 88（12）： 6577-6584

    28?Wu R L， Zhou S， Chen T， Li J J， Shen H B， Chai Y J， Li L S. Anal. Chim. Acta， 2018， 1008： 1-7

    29?Swanson C， D′Andrea A. Chem. Commun.， 2013， 59（4）： 641-648

    30?Park K M， Chung D J， Choi M， Kang T， Jeong J. Nano Converg.， 2019， 6（1）： 35-40

    31?Oh J， Joung H A， Han H S， Kim J K， Kim M G. Theranostics， 2018， 8（12）： 3189-3197

    32?Rey E G， O′Dell D， Mehta S， Erickson D. Anal. Chem.， 2017， 89（9）： 5095-5100

    33?Letchumanan I， Arshad M K M， Balakrishnan S R， Gopinath S C B. Biosens. Bioelectron.， 2019， 130： 40-47

    34?Zhang X， Hu R， Zhang K， Bai R， Li D， Yang Y. Methods-UK， 2016， 8（32）： 6202-6207

    35?Vance S A， Sandros M G. Sci. Rep.， 2014，?4： 5129

    36?Yu R J， Ma W， Liu X Y， Jin H Y， Han H X， Wang H Y， Tian H， Long Y T. J. Nanobiotecg.， 2016， 6（10）： 1732-1739

    37?Zhang L L， Tong S， Zhou J， Bao G. Theranostics， 2016， 6（9）： 1353-1361

    38?Reghuram S， Arivarasan A， Kalpana R， Jayavel R. J. Exp. Nanosci.， 2015， 10（10）： 787-802

    39?O′Reilly E J， Conroy P J， Hearty S， Keyes T E， O′Kennedy R， Forster R J， Dennany L. RSC Adv.， 2015， 5（83）： 67874-67877

    40?Koukouvinos G， Petrou P， Misiakos K， Drygiannakis D， Raptis I， Stefanitsis G， Martini S， Nikita D， Goustouridis D， Moser I， Jobst G， Kakabakos S. Biosens. Bioelectron.， 2016， 84： 89-96

    41?Zubiate P， Zamarreno C R， Sanchez P， Matias I R， Arregui F J. Biosens. Bioelectron.， 2017， 93： 176-181

    42?Iwasaki Y， Kimura T， Orisaka M， Kawasaki H， Goda T， Yusa S. Chem. Commun.， 2014， 50（42）： 5656-5658

    43?Lee S H， Choi S， Kwon K， Bae N-H， Kwak B S， Cho W C， Lee S J， Junga H I. Sens. Actuators B， 2017， 246： 471-476

    44?Fock J， Parmvi M， Stromberg M， Svedlindh P， Donolato M， Hansen M F. Biosens. Bioelectron.， 2017， 88： 94-100

    45?Yang Z， Liu Y， Lei C， Sun X C， Zhou Y. Microchim. Acta， 2015， 182（15-16）： 2411-2417

    46?Zhang Y， Rojas O J. Biomacromolecules， 2017， 18（2）： 526-534

    47?Ouyang M， Di Carlo D. Biosens. Bioelectron.， 2019， 132： 162-170

    48?Belushkin A， Yesilkoy F， Altug H. ACS Nano， 2018， 12（5）： 4453-4461

    49?Sinha A， Tai T Y， Li K H， Gopinathan P， Chung Y D， Sarangadharan I， Ma H P， Huang P C， Shiesh S C， Wang Y L， Lee G B. Biosens. Bioelectron.， 2019， 129： 155-163

    50?Chu C H， Sarangadharan I， Regmi A， Chen Y W， Hsu C P， Chang W H， Lee G Y， Chyi J I， Chen C C， Shiesh S C， Lee G B， Wang Y L. Sci. Rep.， 2017， 7： 5256

    51?Gao J， Meyer K， Borucki K， Ueland P M. Anal. Chem.， 2018， 90（5）： 3366-3373

    52?Ko J A， Lim H B. Anal. Chim. Acta， 2016， 938： 1-6

    53?Tugirimana P L， Drieghe S A， Alsaadi H， Delanghe J R. Clin. Chem. Lab. Med.， 2014， 52（6）： 861-867

    54?Vashist S K， Czilwik G， van Oordt T， von Stetten F， Zengerle R， Marion Schneider E， Luong J H T. Anal. Biochem.， 2014， 456： 32-37

    55?Hwang A， Kim E， Moon J， Lee H， Lee M， Jeong J， Lim E K， Jung J， Kang T， Kim B. ACS Appl. Mater. Interfaces， 2019， 11（21）： 18960-18967

    56?Wang J C， Guo J J， Zhang J J， Zhang W J， Zhang Y Z. Biosens. Bioelectron.， 2017， 95： 100-105

    57?Xie J， Tang M Q， Chen J， Zhu Y H， Lei C B， He H W， Xu X H. Talanta， 2020，?217： 121-127

    58?Kuo Y C， Lee C K， Lin C T. Biosens. Bioelectron.， 2018， 103： 130-137

    59?Wang S F， Luo J J， He Y， Chai Y Q， Yuan R， Yang X. ACS Appl. Mater. Interfaces， 2018， 10（39）： 33707-33712

    60?Lee W S， Sunkara V， Han J R， Park Y S， Cho Y K. Lab Chip， 2015， 15（2）： 478-485

    61?Wang T T， Lio C K， Huang H， Wang R Y， Zhou H， Luo P， Qing L S. Talanta， 2020， 206： 120211

    62?Vashist S K， van Oordt T， Schneider E M， Zengerle R， von Stetten F， Luong J H T. Biosens. Bioelectron.， 2015， 67： 248-255

    63?Dong M L， Wu J D， Ma Z M， Peretz-Soroka H， Zhang M， Komenda P， Tangri N， Liu Y， Rigatto C， Lin F. Sensors， 2017， 17（4）： 684

    64?Ji T H， Liu D， Liu F， Li J X， Ruan Q Y， Song Y L， TIian T， Zhu Z， Zhou L J， Lin H， Yang C Y， Wang D. Chem. Commun.， 2016， 52（54）： 8452-8454

    65?Lin B Q， Liu D， Yan J M， Qiao Z， Zhong Y X， Yan J W， Zhu Z， Ji T H， Yang C Y J. ACS Appl. Mater. Interfaces， 2016， 8（11）： 6890-6897

    66?Joung H A， Oh Y K， Kim M G. Biosens. Bioelectron.， 2014， 53： 330-335

    67?Kim K， Joung H A， Han G R， Kim M G. Biosens. Bioelectron.， 2016， 85： 422-428

    68?Tsai M Z， Hsiung C T， Chen Y， Huang C S， Hsu H Y， Hsieh P Y. Analyst， 2018， 143（2）： 503-510

    69?Qi X P， Huang Y Y， Lin Z S， Xu L， Yu H. Nanoscale Res. Lett.， 2016， 11： 1-8

    70?Lv Y B， Wang F F， Li N， Wu R L， Li J J， Shen H B， Li L S， Guo F. Sens. Actuators B， 2019， 301： 118-127

    71?Park J， Park J K. Sens. Actuators B，?2017， 246： 1049-1055