黑素瘤患者组织中PKM2和HIF-1α的表达及其临床意义

    沈庆华　沈险华

    

    

    

    [摘要]目的：探究黑素瘤患者组织中络氨酸激酶M2（PKM2）以及低氧诱导因子-1α（HIF-1α）表达水平变化及其临床意义。方法：对2018年1月-2019年1月92例在笔者医院接受治疗的黑素瘤患者相关资料进行回顾性分析，患者均为手术治疗，分别测定患者手术获取黑素瘤组织以及黑素瘤旁正常组织中PKM2、HIF-1α表达水平。不同组织PKM2、HIF-1α病理染色结果分析，比较不同组织PKM2、HIF-1α表达水平差异，不同临床特征患者PKM2、HIF-1α表达水平差异，比较不同预后患者PKM2、HIF-1α表達。结果：PKM2和HIF-1α分别在细胞质以及细胞核表达，阳性表达主要显示为棕黄色以及黄色粒状物质，而阴性则显示为蓝色粒状物质。黑素瘤组织PKM2、HIF-1α表达阳性率高于黑素瘤旁正常组织，差异具有统计学意义（P<0.05）;淋巴结转移情况与分化程度不同患者黑素瘤组织中PKM2表达阳性率比较差异有统计学意义（P<0.05）;淋巴结转移情况、分化程度、肿瘤分期不同患者黑素瘤组织中HIF-1α表达阳性率比较差异有统计学意义（P<0.05）。92例患者中位随访时间为10.34个月，随访期内失访3例，剩余89例患者中预后不良患者13例;预后良好组患者黑素瘤组织PKM2、HIF-1α表达均明显低于预后不良组患者，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：黑素瘤患者组织中PKM2、HIF-1α高表达，其表达水平与患者病情进展以及预后情况关系密切，可用于评估患者病情并预测患者预后。

    [关键词]黑素瘤;PKM2表达;HIF-1α表达;临床意义

    [中图分类号]R739.5? ? [文献标志码]A? ? [文章编号]1008-6455（2020）08-0034-04

    Expression of PKM2 and HIF-1α in Melanoma Tissues and its Clinical Significance

    SHEN Qing-hua1，SHEN Xian-hua2

    （1.Surgical Clinic，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，Hubei，China;2.Reproductive Center of Wuhan Kangjian Maternal and Child Hospital，Wuhan 430000，Hubei，China）

    Abstract： Objective? To investigate the changes in expression levels of pyruvate kinase M2 （PKM2） and Hypoxia inducible factor-1α （HIF-1α） in tissues of patients with melanoma and their clinical significance. Methods? The relevant data of 92 patients with melanoma treated in the hospital between January 2018 and January 2019 were analyzed retrospectively. All patients were treated with surgery. The expression levels of PKM2 and HIF-1α in melanoma tissues and normal tissues adjacent to melanoma were determined. Pathological staining results of PKM2 and HIF-1α in different tissues were analyzed. The expression levels of PKM2 and HIF-1α in different tissues， in patients with different clinical features and different prognosis were compared. Results? PKM2 and HIF-1α were expressed in the cytoplasm and the cell nucleus， respectively. The positive expression mainly showed brownish yellow and yellow granular substances， while the negative expression showed blue granular substances. The positive expression rates of PKM2 and HIF-1α in melanoma tissues were higher than those in normal tissues adjacent to melanoma （P<0.05）. There were significant differences in the expression of PKM2 in melanoma tissues of patients with different conditions of lymph node metastasis and different differentiation degrees （P<0.05）. There were significant differences in the positive expression rate of HIF-1α in melanoma tissues of patients with different conditions of lymph node metastasis， different differentiation degrees and different tumor stages （P<0.05）. The median follow-up time of 92 patients was 10.34 months， and 3 patients were lost to follow-up. Among the remaining 89 patients， 13 patients had poor prognosis. The expression of PKM2 and HIF-1α in melanoma tissues of patients with good prognosis was significantly lower than that in patients with poor prognosis （P<0.05）. Conclusion? PKM2 and HIF-1α are highly expressed in patients with melanoma. The expression levels are closely related to the patient's disease progression and prognosis. They can be used to evaluate the patient's condition and predict the prognosis.

    Key words： melanoma; expression of PKM2; expression of HIF-1α; clinical significance

    黑素瘤为身体器官与皮肤黑素细胞恶性增殖所致肿瘤，所有肿瘤患者中有1%～3%即为黑素瘤，但是患病后恶性程度严重[1]。该病多见于皮肤和黏膜，其致病原因多与环境影响以及基因变异有关，其中最重要环境影响因素为长期紫外线照射。目前临床上对其治疗主要采取放化疗、液氮冷冻、病灶手术切除以及生物治疗等方式，但是患者治疗效果不佳。既往研究[2]指出，黑素瘤病情进程与细胞周期调节、转录因子以及抑癌基因等众多蛋白表达水平有关，对患者病情相关蛋白表达水平与临床意义研究有利于黑素瘤患者病情评估、治疗方式选择以及预后预测。大部分细胞在氧气正常存在时通过有氧氧化作用将葡萄糖分解达到获得代谢所需能量目的，肿瘤细胞中糖酵解代谢作用较正常细胞更活跃，因此细胞内部葡萄糖含量减少，乳酸大量积聚，研究者们将这种作用称为Warburg效应[3]。络氨酸激酶（M2 type pyruvate kinase，PKM2）以及低氧诱导因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）共同参与糖酵解作用，两者水平变化与肿瘤病情发展关系密切[4]。目前PKM2、HIF-1α表达水平变化多见于其他类型肿瘤如胃癌、喉鳞状细胞癌等[5-6]。本研究为了解黑素瘤患者组织中PKM2、HIF-1α表达及临床意义，对笔者医院近年内收治黑素瘤患者相关资料予以分析，现报道如下。

    1? 资料和方法

    1.1 一般资料：对2018年1月-2019年1月在笔者医院进行治疗的92例黑素瘤患者相关资料进行回顾性分析。纳入标准：①确诊为黑素瘤;②采用手术进行治疗患者;③一般资料、各项蛋白检测资料以及随访资料完整患者。排除标准：①并发其他肿瘤;②采用非手术方式进行治疗;③存在手术治疗禁忌证;④相关资料不完整。92例患者中男48例，女44例;年龄20～78岁，平均（59.32±4.23）岁;皮肤黑素瘤80例，其他种类黑素瘤12例;病程1～12年，平均（8.15±1.37）年;淋巴结转移与不转移患者分别33例和59例;肿瘤分期：Ⅰ～Ⅱ期与Ⅲ～Ⅳ期分别75例和17例;分化程度：低分化、中分化以及高分化分别20例、32例以及40例。

    1.2 方法

    1.2.1 蛋白水平测定：所有患者经由手术切除黑素瘤组织以及黑素瘤旁正常组织立即采用4%多聚甲醛予以固定，应用石蜡予以包埋后进行切片，切片后经常规处理后滴加山羊血清于37℃环境进行封闭处理，30min后将液体弃去，添加合适浓度一抗在4℃环境下予以过夜，第2天将液体弃去后采用PBS缓冲液进行冲洗，随后滴加生物素标记山羊抗兔二抗在37℃湿盒环境下进行30min孵育。孵育完成后应用PBS进行清洗，添加辣根酶标记链霉素卵白素工作液相同湿盒环境孵育相同时间后再次应用PBS清洗，随后添加显色液予以显色，显色标准为特异性显色与背景分别显色最强与不显色。自来水冲洗后进行复染、盐酸乙醇分化、反蓝、脱水、透明封片等处理。阴性对照使用PBS一抗替代，随后在显微镜下进行观察拍照。

    1.2.2 蛋白表达水平结果判断：蛋白表达分析结果应用400倍显微镜下分析5张随机不同视野图片，依据阳性细胞率以及染色程度进行判定[7]，将阳性细胞率<1%、≥1%且<25%、≥25%且<50%、≥50%且<75%、≥75%依次赋分0分、1分、2分、3分、4分;按照染色强弱程度将棕褐色记为3分、棕黄色记为2分、黄色记为1分、无色记为0分。最终结果为阳性率评分与染色强弱程度之积，低于4分为阴性，反之则为阳性。整个结果均由2名医师进行阅片以及评分，最终按照评分平均值进行评定。

    1.2.3 预后情况：患者术后接受随访，随访终末时间为2019年8月31日，依据随访资料判断患者预后情况，包括病情复发、存活以及死亡等，其中预后不佳为患者病情复发或者死亡，反之则为预后良好。

    1.3 观察指标：比较不同组织PKM2、HIF-1α表达水平差异，不同临床特征患者PKM2、HIF-1α表达水平差异，分析黑素瘤患者组织中PKM2、HIF-1α表达之间相关性，比较不同预后患者PKM2、HIF-1α表达。

    1.4 统计学分析：本研究所有数据均采用SPSS 20.0软件进行处理，计量资料与计数资料分别采用t检验与χ2检验进行差异比较，依次表示为（均数±标准差）与例（%），相关性分析应用Spearson相关性分析，P<0.05为差异有统计学意义。

    2? 结果

    2.1 不同组织PKM2、HIF-1α病理染色结果分析：PKM2主要在细胞质表达，阳性表达主要显示为棕黄色以及黄色粒状物质，而阴性则显示为蓝色粒状物质;HIF-1α主要在细胞核表达，阳性表达主要显示为棕黄色以及黄色粒状物质，而阴性则显示为蓝色粒状物质。

    2.2 不同组织PKM2、HIF-1α表达比较：黑素瘤组织PKM2、HIF-1α表达阳性率高于黑素瘤旁正常组织，差异具有统计学意义（P<0.05），见表1。

    2.3 不同临床特征患者PKM2、HIF-1α表达水平比较：淋巴结转移情况与分化程度不同患者黑素瘤组织中PKM2表达阳性率比较差异有统计学意义（P0.05）。淋巴结转移情况、分化程度、肿瘤分期不同患者黑素瘤组织中HIF-1α表达阳性率比较差异有统计学意义（P0.05）。见表2。

    2.4 不同预后患者黑素瘤组织PKM2、HIF-1α表达比较：92例患者随访时间为2～16个月，中位随访时间为10.34个月，随访期内失访3例（包括1例PKM2、HIF-1α均阳性，1例HIF-1α阳性及1例PKM2、HIF-1α均阴性），剩余89例患者中预后不良患者13例，其中死亡1例，复发12例。预后良好组患者黑素瘤组织PKM2、HIF-1α表达均明显低于预后不良组患者，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

    3? 讨论

    黑素瘤为黑素细胞发生恶性增殖所致肿瘤，较常发生于皮肤，且皮肤黑素瘤疾病程度较其他类型黑素瘤严重，患者预后较差[8]。相关调查显示黑素瘤早期患者采用手术方式治疗5年生存率为95%，但是中晚期黑素瘤患者预后较差且尚无有效方式改善患者预后[9]。临床上常采用放化疗、手术、靶向治疗、物理治疗以及免疫治疗等中超过两种方式联用治疗，虽然治疗效果改善，但因此所致副作用也会增加，所以需要深入了解黑素瘤发生以及进展机制，以明确其抗肿瘤方式。

    研究发现，丙酮酸激酶（PK）作为限速酶可在糖酵解过程中发挥将磷酸烯醇丙酮酸羧激酶催化成丙酮酸作用，此过程伴随有能量生成[10]。PKM2为PK四种同工酶之一，其主要分布于核酸合成频繁且不停增殖细胞与胚胎组织中，特别是恶性肿瘤细胞。本研究中黑素瘤组织PKM2表达阳性率显著高于黑素瘤旁正常组织，与马素珍等[11]研究结论一致，黑素瘤组织细胞增殖较正常组织更频繁，需要更多能量，糖酵解代谢作用较强，PKM2表达水平越高。另有研究显示[12]通过shRNA介导PKM2基因表达沉默促进了大肠癌细胞凋亡，抑制了细胞有氧糖酵解、增殖、迁移和侵袭，进一步显示出PKM2主要通过介导机体糖酵解过程促进肿瘤细胞进程。此外，通过对不同临床特征患者黑素瘤组织PKM2表达阳性率分析发现，淋巴结转移以及分化程度越低患者瘤组织中PKM2显示为高表达状态，肿瘤组织分化程度低，显示细胞增殖快速，所需能量多，所以该部位糖酵解反应更剧烈，出现转移可能性更大，可见黑素瘤组织中PKM2高表达能够显示出患者肿瘤细胞增殖速度快、侵袭性强、转移率高，处于这种状态患者病情相对较为严重，预后较差。本研究随访结果分析同样证实黑素瘤组织中PKM2高表达患者预后较差，与患者病情状态情况相符。

    低氧时，HIF-1组成成分之一氧反应基（HIF-1α）分解作用减少，其水平在细胞中增加，促进肿瘤细胞能量循环以及生理过程，诱使肿瘤细胞得以在氧气供应不足状态生长[13-14]。研究显示，众多人类肿瘤中如食管鳞癌、三阴性乳腺癌患者中HIF-1α均处于过表达状态[15-16]。本研究中黑素瘤组织HIF-1α表达阳性率显著高于黑素瘤旁正常组织，同时淋巴结转移、分化程度低以及肿瘤分期高患者黑素瘤组织中HIF-1α显示出高表达趋势，提示HIF-1α不仅能有诱导黑素瘤细胞增殖，同时还在病灶转移与侵袭过程中发挥重要作用。肿瘤细胞增殖过快导致需要大量氧气以及能量，血管血氧供应速度不及肿瘤细胞增殖速度，所以机体出现缺氧情况，而HIF-1α在氧气缺乏时大量增加，有效与HIF-1β结合形成HIF-1，而HIF-1可以调节机体多种细胞因子如血管内皮生长因子、转化生长因子或糖酵解酶如PKM2、乳酸脱氢酶水平，上述因子介导了黑素瘤细胞整个能量生成、细胞增殖以及生长等过程，诱使黑素瘤细胞可以适应于缺氧环境，促进细胞存活。本研究随访结果显示，预后良好组患者黑素瘤组织HIF-1α表达均明显低于预后不良组患者，表明HIF-1α不仅可以用于评估患者病情情况，还可以用于预测患者预后情况。.

    黑素瘤患者组织中PKM2、HIF-1α显示出高水平表达，两者一同介导了黑素瘤细胞增殖、转移以及侵袭，其对患者病情判断以及预后评估均具有重要指导意义。

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    [收稿日期]2019-12-20

    本文引用格式：沈庆华，沈险华.黑素瘤患者组织中PKM2和HIF-1α的表达及其临床意义[J].中国美容医学，2020，29（8）：34-37.