IL-1β经NK-kB通路对牙周膜干细胞成骨成分调控的机制研究
李群 周纯香
[摘要]目的：探討IL-1β经NK-kB通路对炎症状态下牙周膜干细胞成骨成分调控机制。方法：从正常牙周组织和慢性牙周炎组织采用组织消化和有限稀释法获取不同来源的人牙周膜干细胞（hPDLSCs），采用免疫细胞化学法和流式细胞仪检测两种源细胞表面标志分子表达，采用MTT和细胞周期检测间充质干细胞增殖能力;间充质干细胞多向分化能力检测采用成骨和成脂分化诱导。构建IL-1β（l0ng/ml）模拟牙周炎症微环境模型，加入NF-kB信号通路抑制剂BAY 11-7082，研究牙周膜干细胞缺失性功能研究。结果：体外有限稀释法结果表明，两种来源间充质干细胞均具有自我更新能力，MTT和细胞周期检测表明牙周炎组干细胞增殖能力优于对照组，炎症因子IL-1β处理的正常组牙周膜干细胞可激活NF-kB通路，在IL-1β处理同时加入BAY 11-7082后成骨有关基因及蛋白表达水平增加。结论：炎症因子IL-1β可激活NF-kB信号通路，并且可抑制牙周膜干细胞向成骨分化;对NF-kB信号通路抑制后能够明显逆转IL-1β导致的干细胞成骨分化能力降低。
[关键词]IL-1β;NK-kB通路;牙周膜干细胞;炎症微环境;成骨分化
[中图分类号]R780.2? ? [文献标志码]A? ? [文章编号]1008-6455（2020）09-0095-05
Analysis of the Regulation Mechanism of IL-1β on Osteogenesis of Periodontal Ligament Stem Cells Via NK-kB Pathway
LI Qun1， ZHOU Chun-xiang2
（1.Department of Stomatology，the First Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Changsha 410007，Hunan，China;2.Department of Stomatology，Yongzhou Central Hospital，Yongzhou 425000，Hunan，China）
Abstract： Objective? To investigate the regulation mechanism of IL-1β on the osteogenesis of periodontal ligament stem cells in inflammatory state by NK-kB pathway. Methods? Human periodontal ligament stem cells （hPDLSCs） from different periodontal tissues and chronic periodontitis tissues were obtained by tissue digestion and limiting dilution method. The expression of cell surface marker molecules was detected by immunocytochemistry and flow cytometry. At the level， the proliferation of mesenchymal stem cells was detected by MTT and cell cycle; the multi-directional differentiation ability of mesenchymal stem cells was induced by osteogenic and adipogenic differentiation. Subsequently， IL-1β （10ng/ml） was used to simulate the periodontal inflammatory microenvironment and the NF-kB signaling pathway inhibitor BAY 11-7082 was added to study the function of periodontal ligament stem cell deletion. Results? In vitro limiting dilution method showed that both mesenchymal stem cells had self-renewal ability. MTT and cell cycle assay showed that the proliferative ability of stem cells in periodontitis group was better than that in control group， and the normal group of periodontal ligament stem cells treated with inflammatory factor IL-1β. The NF-kB pathway can be activated， and the expression levels of osteogenic genes and proteins are increased after the addition of BAY 11-7082 to IL-1β treatment. Conclusion The inflammatory factor IL-1β can significantly activate the NF-kB signaling pathway and negatively regulate the osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells. Inhibition of NF-kB can effectively reverse the decline in osteogenic differentiation induced by IL-1β.
Key words： IL-1β; NK-kB pathway; periodontal ligament stem cells; inflammatory microenvironment; osteogenic differentiation
牙周病可引起牙周頜骨及结缔组织萎缩缺损，缺损处骨骼及软组织重建为近年口腔科研究的热点。Seo等[1]在2004年由健康牙周组织体外培养分离出牙周膜干细胞。随后Osawa[2]和Cetinkaya B[3]等研究证实炎症牙周组织和牙髓中存在有关的干细胞存在。因此，牙周组织有关干细胞在牙周缺损修复中具有重要意义，且炎症有关因子在干细胞修改作用中具有调节功能。炎症对干细胞微环境稳态具有破坏作用，对干细胞内源性信号调控作用可能具有一定的影响[4]。因此，牙周炎导致的牙周结缔组织萎缩可能与人牙周膜干细胞（Human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）生物学功能受炎症因子影响相关。NK-кB在慢性牙周炎发展中为一个具有关键性炎症调控者的作用，NK-кB信号通路激活可促进TNF-α、IL-1β等炎症因子的表达，这些炎症因子作为激动剂可进一步作用于NK-кB信号通路，增加该信号通路的活性[5]。基于上述相关报道，本研究探讨PDLSCs在炎症状态下NK-кB和IкB表达水平的变化以及Nk-KB信号通路对炎症状态下PDLSCs成骨分化的调控机制，以期为临床治疗慢性牙周炎提供一定的依据。
1? 资料和方法
1.1 主要试剂：抗STRO-1抗体（购自美国R&D Systems公司），羊抗鼠荧光二抗（购自中国Boster公司），ALP显色试剂（购自中国Beyotime公司），TRIzol Reagent（购自美国Invitrogen公司），Real-time PCR试剂盒、逆转录试剂盒（购自日本TaKaRa公司），抗人Runx2、β-actin抗体（购自美国Abcam公司），鼠抗人二抗、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠/抗兔IgG（购自中国博士德公司），IкBa抗体、β-IкBa抗体、HDAC-1抗体、BAY 11-7082（购自美国Cell signaling公司），细胞核蛋白与胞浆蛋白抽提试剂盒（购自美国Millipore公司）。
1.2 样本收集：正常组样本来源于笔者医院口腔科门诊正畸患者10例，年龄23～35岁;炎症组样本来源于笔者医院口腔科门诊治疗的慢性牙周炎患者8例，年龄24～37岁。
1.3 实验方法
1.3.1 干细胞原代培养和克隆：取两组牙周组织进行细胞原代培养，然后采用有限稀释法克隆培养牙周膜干细胞。本研究采用第3～4代多克隆干细胞。
1.3.2 干细胞表型分析
1.3.2.1 细胞免疫荧光法：取两组处于对数生长期的第3代细胞，用细胞免疫荧光法分析干细胞表面分子表达水平，阴性对照为PBS。
1.3.2.2 流式细胞仪分析：取两组处于对数生长期的第3代细胞（1×106个/ml），用流式细胞仪检测荧光表达率。研究组细胞加入FITC、PE小鼠抗人CD14、CD29、CD44、CD45、CD90、CD105、CD146抗体，阴性对照加入FITC、PE标记的小鼠IgG。
1.3.2.3 MTT和周期分析：取两组处于对数生长期的第3代细胞，运用MTT法绘制生长曲线。并取两组处于对数生长期的第3代细胞，处理后4℃保存以备进行周期分析。
1.3.2.4 干细胞诱导分化实验：取两组处于对数生长期的第3代细胞，分别进行成骨诱导和成脂诱导，并进行矿化结节定量分析和脂滴定量分析。
1.3.3 Real-time RT-PCR检测和Western blot检测：按照TRIZOL Reagent说明书提取干细胞RNA，并测定纯度，然后按照PrimeScriptTM RT-PCR kit试剂盒说明合成cDNA，计算反转录体系所需RNA量。按照SYBR? Premix Ex TaqTM试剂盒说明将反转录获得的cDNA加入扩增体系，置于CFX96TM Real-time System检测。并对两种经成骨诱导干细胞蛋白用Western blot进行检测。
1.4 NF-кB信号通路研究：取正常组处于对数生长期的第4代细胞分为对照组和诱导组。对照组采用成骨诱导液培养7d，诱导组使用含有IL-1β（10ng/ml）的成骨诱导液培养7d。弃培养基加入新鲜培养基培养1h后提取细胞RNA和胞质/胞核蛋白，用Real-time RT-PCR和Western blot进行检测。
1.5 统计学分析：采用SPSS 20.0统计学软件进行统计分析;组间对比采用t检验分析，当P<0.05时差异具有统计学意义。
2? 结果
2.1 两种来源PDLSCs细胞形态学观察：对组织行原代培养3～8d后可见牙周膜组织块边缘存在牙周膜细胞爬出（见图1A、D），大多数细胞镜下形态为长梭形或不规则形。采用有限稀释法克隆培养干细胞8d即可出现细胞克隆，获得正常组PDLSCs（见图1B）和炎症组PDLSCs（见图1E）。倒置显微镜观察，可见两种来源细胞呈纺锤形（见图1C、F）。两种来源PDLSCs形态学无差异。
2.2 两种来源PDLSCs细胞表型：两种来源PDLSCs细胞行荧光化学分析显示均表达Seto-1（见图2）。经流式细胞仪分析显示，两种来源细胞均表达CD29、CD44、CD90、CD105、CD146，但未表达CD14、CD31及CD45（见图3）。
2.3 两种来源PDLSCs细胞增殖能力比较：细胞周期检测结果表明，正常组PDLSCs细胞G2+S期约占20.4%，炎症组为36.1%;连续7d MTT检测结果表明，两种来源干细胞在培养第3天进入对数生长期，第4～5天为增殖期，第6天为平台期，对数生长期开始两种来源PDLSCs细胞增殖能力存在差异性。见图4。
2.4 两种来源PDLSCs分化能力对比：对两种来源PDLSCs进行成骨诱导7d，行ALP染色结果显示，正常组PDLSCs染色较炎症组深，茜素红染色结果显示，正常组PDLSCs矿化结节较炎症组多;ALP定量与矿化结节定量分析表明正常组PDLSCs分化能力高于炎症组（见图5）;Real-time PCR检测表明，正常组PDLSCs的Runx2、ALP、OCN及Osterix mRNA表达高于炎症组（见图6）;Western blot检测结果表明，正常组PDLSCs Runx2和Osterix蛋白表达水平高于炎症组。对两种来源PDLSCs进行成脂诱导14d，采用油红O染色后结果显示，两组细胞脂滴形态无差别，但正常组PDLSCs脂滴数量及体积大于炎症组;Real-time和Western blot结果表明，成脂诱导7d正常组PPAR-γ基因和蛋白表达较炎症组高。
2.5 炎症组PDLSCs成骨分化过程NF-кB信号通路激活增强：Western blot检测结果表明，随成骨诱导时间延长，Runx2蛋白表达水平随之增加，且正常组PDLSCs Runx2蛋白表达水平高于炎症组;两种来源PDLSCs成骨诱导时p65和p-IкBα蛋白表达增加，而炎症组PDLSCs胞质p65和胞核p-IкBα蛋白表达水平高于正常组，见图7。
2.6 阻断NF-кB信号通路可促进hPDLSCs成骨分化：Western blot检测结果表明，加入BAY 11-7082可抑制hPDLSCs胞质中p65和IкBα蛋白表达，且胞核中p65表达也有所降低。见图8。
2.7 IL-1β体外模拟炎症微环境对PDLSCs成骨分化能力的影响：ALP、茜素红及定量结果表明，IL-1β组ALP和茜素红着色与对照组相比较浅，定量结果则一致（见图9A～B）。Real-time RT-PCR检测表明，成骨诱导7d，干预组Runx2和Osterix基因表达较对照组降低（见图9C～D）;Western blot检测结果表明，IL-1β组Runx2和Osterix蛋白表达较对照组低。
2.8 IL-1β对PDLSCs的NF-кB通路影响：IL-1β组胞质中p65和IкBα蛋白表达水平降低，但磷酸化IкBα水平上升;胞核内p65表达水平与对照组对比增加（见图10）。
3? 讨论
目前，大量研究发现PDLSCs在牙周组织再生中具有重要作用[6-7]，而在慢性炎症中，牙周组织缺损与再生异常可能是因为PDLSCs功能异常导致[8]。本研究收集牙周健康患者和牙周炎患者牙周膜，采用有限稀释法进行离体培养。实验结果表明，两种不同来源PDLSCs细胞形态呈纺锤形，并且已螺旋簇集落生长，在形态学上无差异。则证实PDLSCs形态与炎症无相关性，与有研究结果相符。目前，间充质干细胞表面标志物鉴定为细胞鉴定的主要方式，PDLSCs为间充质干细胞的一种，与其他间充质干细胞表面标志物表达无差异，可特异性的表达Stro-1等分子标记物[9]。两种来源PDLSCs表面标志物表达无差异，但炎症组PDLSCs克隆形成率更高，则证实微环境改变对PDLSCs增殖能力具有调节作用。为了验证上述结果，本研究采用流式细胞仪检测细胞周期与MTT检测细胞增殖能力，研究结果表明炎症组PDLSCs细胞增殖能力高于正常组。因此，可推测PDLSCs受到炎症因子刺激后发生功能性缺陷，但细胞通过增强自我增殖能力达到功能性代偿的作用。当然，也可能因炎症作用促进PDLSCs增殖，但尚需进一步的研究证实。对两种来源PDLSCs细胞进行成骨成脂诱导，两种来源PDLSCs细胞矿化结节和脂滴出现，由此证实两种来源PDLSCs均具有多向分化能力，但炎症组PDLSCs成骨与成脂分化能力较弱。成骨分化过程中，ALP活性越高表明细胞向成骨方向分化的程度越高，分泌矿化基质的能力也越高。Runx2和Osterix为干细胞中重要的转录因子，Runx2和Osterix表达水平为成骨分化能力的反应指标。PDLSCs成骨诱导分化7d ALP染色和诱导21d茜素红染色表明，正常组PDLSCs矿化能力高于炎癥组。除此之外，PDLSCs成骨诱导后，正常组PDLSCs成骨有关基因Runx2和Osterix表达水平与炎症组相比较高。上述研究结果证实牙周炎来源PDLSCs成骨能力受损。对PDLSCs进行成脂诱导14d，行油红O染色证实正常组PDLSCs脂滴数量与炎症组相比更多。成脂有关基因PPAR-γ在炎症组PDLSCs表达水平低于正常组PDLSCs。上述研究证实炎症组PDLSCs成脂分化能力较弱。
转录因子NF-кB在炎症和免疫应答中具有重要的作用[10-11]。对关节炎进行研究发现，采用特异性抑制剂IKK可抑制破骨细胞形成缓解炎症导致的骨丧失，则表明NF-кB在炎性骨疾病中具有重要作用[12]。虽然NF-кB在破骨细胞形成中作用已证实，但NF-кB在成骨细胞活性、骨形成等的作用研究较少。在本研究中，采用IкBα抑制剂BAY 11-7082能够特异性阻断NF-кB信号通路，可增正常组PDLSCs细胞增殖能力且对炎症组PDLSCs增殖能力也有一定的促进作用。说明在炎症条件下NF-кB信号通路被激活，进而引起PDLSCs成骨分化能力降低。
慢性牙周炎患者龈沟液中的炎性因子水平高于正常人群，而牙周炎中主要的炎症因子之一为IL-1β[13]。IL-1β可持续活化NF-кB，活化后可加重局部组织炎症反应，且能够通过各种信号通路抑制炎症组PDLSCs向成骨分化。在NF-кB经典信号通路中，活化的IKK磷酸化IкB特异性丝氨酸残基使IкB磷酸化被降解。IкB被降解后，转录因子NF-кB可由蛋白复合体中释放，并且由胞质转移至胞核，与DNA上的кB位点结合，活化NF-кB信号通路下游基因[14]。虽然，IL-1β调节作用较为复杂，且作用机制尚未明确，但可以肯定IL-1β促炎效果则主要为通过持续激活NF-кB发挥作用[15]。在本研究中，IL-1β处理的正常组PDLSCs成骨分化能力明显降低，且p-IкBα及核内p65表达水平升高，说明IL-1β可抑制PDLSCs成骨分化可能是通过NF-кB通路介导发挥作用。这与叶炜等研究结果相似[16]。在PDLSCs细胞中加入IL-1β和BAY 11-7082可使炎症组PDLSCs成骨分化能力有所恢复。证实NF-кB具有介导IL-1β对PDLSCs成骨分化的调节作用。
综上所述，炎症因子IL-1β可激活NF-kB信号通路，并且可抑制牙周膜干细胞向成骨分化;对NF-kB信号通路抑制后能够明显逆转IL-1β导致的干细胞成骨分化能力降低。
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[收稿日期]2019-12-23
本文引用格式：李群，周纯香.IL-1β经NK-kB通路对牙周膜干细胞成骨成分调控的机制研究[J].中国美容医学，2020，29（9）：95-99.
