裂解气相色谱-质谱法分析土壤有机质的化学组成
蒋逸凡 喻文娟 王姣娇 康宏樟
摘?要?土壤有机质（SOM）是土壤的重要组成部分，对土壤的肥力、水分含量等各种性质具有重要作用。本研究采集了中国东部7个地区不同深度的土壤，采用直接进样-热裂解-气相色谱/质谱法（Py-GC/MS，直接进样法）和四甲基氢氧化铵衍生-热裂解-气相色谱/质谱法（TMAH-Py-GC/MS，TMAH衍生法），对土壤有机质进行了定性和半定量分析。TMAH衍生法采用25%TMAH的甲醇溶液浸没24 h进行衍生化，选择DB-5 ms（30 m×0.25 mm， 0.25 μm）色谱柱进行气相色谱-质谱分析，测试条件与直接进样法相同。TMAH衍生法和直接进样法分别鉴定出261种和117种土壤有机质的标识物，TMAH衍生法检测到的物质种类更多、结构更多样，显著提高了木质素类和脂质类标识物的数目。两种方法检测出的各类物质含量也存在差异，直接进样法中多糖（28%）、脂质（22%）占比较高;TMAH衍生法中脂质（33%）含量较高，其它类物质除酚类化合物外，含量均接近10%。烷烃、烯烃、脂肪酸等物质的色谱峰保留时间与碳原子数之间线性关系显著，相关系数（R2）均大于0.95。 同时还对比了两种方法所获得的六大类物质百分含量随土壤深度与纬度变化规律的异同。
关键词?土壤有机质; 四甲基氢氧化铵; 化学组成; 热裂解-气相色谱/质谱法
1?引 言
土壤有机质（SOM）是土壤中所有含碳有机物的总称，主要包括动植物残体、微生物及其分解和合成的各种有机物。土壤中的有机质含量虽然很低，但对土壤的肥力、水分含量、微生物活动都具有重要作用。由于土壤有机质的总含碳量巨大（其数值高于大气和植被含碳的总和），能够显著影响大气二氧化碳浓度和全球气候，因而受到广泛关注[1]。
目前，研究土壤有机质化学组成的方法包括X射线吸收近边结构谱（XANES）[2]、热裂解场电离质谱（Py-FIMS）[3]、核磁共振（NMR）[4]等技术。XANES是研究分子化学结构和电子结构的有效工具， 利用不同元素有不同的吸收边能量的原理，分析物质的局域结构和局域电子特性，在矿物土壤的研究中可以分析碳和氮的形态构成[5]。Py-FIMS能够非靶向表征主要的土壤有机质，被认为比热裂解-气相色谱/质谱法（Py-GC/MS）在定量分析方面更具优势。但是， 在化合物的具体鉴定方面，Py-FIMS鉴定种类相对偏少[6]。NMR的原理是在磁场内的原子核吸收能量产生核磁共振，由电子云差异产生特征化学位移，进而对物质进行鉴定。固态13C核磁共振波谱在研究土壤有机质中较为常用，其优点是能够直接分析土壤样品中的化学组成，避免提取过程中如热解、萃取等带来的物质结构变化，使分析结果更为真实[7]， 但仅能获取碳骨架信息，无法获得分子单体信息[8]。
直接进样-热裂解-气相色谱/质谱法（Py-GC/MS，直接进样法）是研究土壤有机质化学组成的重要手段之一[9]。该方法通过高温裂解的办法，使有机质中的生物大分子裂解为可挥发的小分子，导入到GC/MS系统中进行分析，依据裂解产物的定性（质谱图，结合标准谱库）和定量（峰面积百分含量）信息，结合产物归属，研究土壤有机质的化学组成。由于各种物质在相同条件下进行热裂解，所产生的各种碎片的相对分子质量及其含量均稳定，因此该方法具有很好的可重复性[10]。
直接进样法自身也存在一些缺点，其中最显著的是难以检出极性较大的物质。普通的非极性色谱柱难以吸附带有氨基、羟基、羧基的极性物质，同时相较其它物质而言，这些物质更难挥发[11]。为了解决这一问题，本研究采用了一种衍生化法对样品进行处理，即使用四甲基氢氧化铵（TMAH）将酚类与脂肪酸中的羟基甲基化[12]，转化为甲氧基。四甲基氢氧化铵衍生-热裂解-气相色谱/质谱法（TMAH-Py-GC/MS，TMAH衍生法）在检测土壤脂肪酸（FAs）方面效果突出[13]。另外，由于TMAH衍生法在检测木质素（Lignin）、角质中的优势[14]，以及在研究单宁类物质时，因其操作简便和效果突出，受到了越来越多的关注[15]。目前， 已有一些利用直接进样法或者TMAH衍生法研究土壤有机质化学组成的报道，但很少有研究同时利用这两种方法综合获取更全面的土壤有机质化学组成的信息，并对两种方法的结果进行详细的比较。
由于纬度不同， 植被组成、温度、降水、光照等环境差异，可能对土壤有机质产生影响，进而产生有机质组成差异。在不同地区选择统一的栓皮栎树种（东亚分布最广树种之一），能够有效去除不同优势树种对土壤有机质化学组成的影响，从而集中探讨区域尺度上其它环境因素的影响。本研究以纬度梯度上不同深度的栓皮栎次生林土壤样品为研究对象，对直接进样法和TMAH衍生法的定性与定量结果进行比较与考察。同时， 因两种方法样品处理方式和目标化合物的差异，其分析结果可互相弥补，从而更加全面地分析土壤有机质化学组成随纬度和土壤深度的变化规律。
2?实验部分
2.1?儀器与试剂
EGA/PY-3030D热裂解仪（PY， 日本Frontier公司）; 7890B-5977B气相色谱-质谱仪（GC-MS， 美国Agilent公司）。
分析纯TMAH（25%的甲醇溶液， 上海阿拉丁（Aladdin）公司）。
2.2?取样时间、地点与方法
土壤样品于2014年7月在中国东部的7个地区被采集，纬度跨越从北京（40.25°N， 117.12°E）至江西（29.09°N， 115.62°E）。所有地点均为天然次生栓皮栎森林，在至少50年内未受过人类直接活动以及野火的干扰。按照美国农业部土壤分类标准，这些土壤可分为3个土壤目：北京平谷（PG）、河北易县（HYS）和河北邢台（BA）为新成土，安徽宿州（HZY）和河南信阳（XY）为始成土，安徽黄山（HS）和江西永修（YS）为老成土[16]。
每一个取样地点建立3个平行横断面，每一个横断面之间间隔20 m，一个横断面上每隔5 m设立1个取样点，共设立10个取样点。在每个取样点的0～2 cm、 2～5 cm、 5～10 cm、 10～20 cm深度分别采集土样，并按横断面混合，每个取样地点共采集12个样品（4个深度 × 3个重复），总样品数为84个（12个样品 × 7个取样地）。
2.3?样品处理
在直接进样法中，针对每一个样品，均匀称取5 mg风干过筛的土样，倒入仪器专用的铝坩埚中，插入样品固定钩后放入仪器中，上机测试。
在TMAH衍生法中，针对每一个样品，均匀称取5 mg风干过筛的土样，倒入仪器专用的铝坩埚中，加入20 μL TMAH含量为25%的甲醇溶液，使样品完全被浸没，反应24 h后，上机测试。
2.4?测试条件
直接进样法与TMAH衍生法采用相同的测试条件。EGA/PY-3030D热裂解仪（PY）与气相色谱-质谱仪（GC-MS）联用; 裂解条件： 单击模式，600℃瞬间裂解; 色谱柱： DB-5ms（30 m×0.25 mm， 0.25 μm）; 进样温度： 300℃; 分流比： 20∶1; 载气： 氦气（99.999%）; 流量： 1 mL/min; 柱温： 40℃保持5 min， 以5℃/min升至310℃，保持5 min; 接口温度： 300℃; 离子源温度： 230℃; 四极杆温度： 150℃; 电离方式： EI+，70 eV; 检测器电压： 1438 V; 扫描方式： 全扫描; 溶剂延迟： 2 min; 扫描范围： 20～500; 标准谱库： NIST 2014谱库。
2.5?数据分析
在定性分析中，由于土壤有机质裂解产物组成复杂，因此本研究主要采用以下3种方法对裂解产物进行定性分析： （1）将裂解产物质谱图的特征离子峰与文献和NIST 2014标准谱库进行比对，选取比对结果中系统匹配度较高（大于800）或关键质谱碎片能够互相匹配的化合物; （2）检索了近百篇相关文献，提炼了6篇含有大量化合物质谱碎片的文章[17～22]，将其中的化合物关键质谱碎片信息提取出来，自建一个包含278种物质质谱信息的数据表格进行人工比对，以弥补NIST 2014标准谱库所含化合物质谱信息有限的缺陷，拓宽了化合物的检测范围; （3）基于现阶段木质素裂解产物还未被全部确认的问题，除了检索文献以外，本研究使用纯木质素样品进行衍生化裂解，构建出木质素裂解产物数据库，为木质素的归类提供可靠的参考依据。本研究将所有已鉴定的物质分为6个大类： 木质素（Lignin）、脂质（Lipid）、含氮化合物（N-bearing）、多糖（Polysaccharide）、非木质素的芳香族（Non-lignin aromatic）和酚类（Phenol），并记录了各检出物质的化学名称、化学式、结构式、所属大类、保留时间以及相对分子质量。
定量分析采用半定量分析法，即以某一特征化合物的峰面积除以所有检出的化合物峰面积之和，记为其相对百分比。再将各类物质的裂解产物含量相加，获得其在土壤有机质中的含量。
对于上述分析后所得的数据，本研究使用Origin软件（OriginLab， Hampton， USA）进行了保留时间与碳原子数目的线性回归分析，使用SPSS软件（IBM SPSS， Armonk， USA）进行了方差分析和Duncan两两比较，用SIMCA-P软件（Umetrics， Ume， Sweden）进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA）。
3?结果与讨论
3.1?TMAH衍生法与直接进样法的对比
3.1.1?色谱图的比较?选取YS样地0～2 cm深度的土壤样品，将两种方法所获得的有机质色谱图进行对比发现，TMAH衍生法所得到的色谱峰整体响应高于直接进样法所得的色谱峰，表明TMAH衍生法的灵敏度更高（图1）。这与Chefetz等[12]在利用两种方法分析土壤有机质腐殖酸时得出的结果类似。
3.1.2?定性与定量结分析果的比较?表1列出了两种方法在各类物质检测数目上的差异，仍以YS样地0～2 cm深度的土壤样品为例，除少部分物质无法鉴定外， TMAH衍生法共鉴定出了261种土壤有机质的标识物（电子版文后支持信息表S1，S2），其中有243种被成功归纳至6个大类中，而直接进样法只鉴定出了117种（电子版文后支持信息表S3），TMAH衍生法显著提高了木质素类和脂质类标识物的数目。同时，TMAH衍生法检测的物质结构更多样，例如，对于脂肪酸的标识物，直接进样法主要检测出直链饱和脂肪酸，而TMAH衍生法则可以检测出支链脂肪酸、羟基脂肪酸、不饱和脂肪酸以及双脂肪酸。相对于传统裂解技术，TMAH衍生法使木质素的酚羟基和羧基被甲基化，从而使更多的木质素的标识物被检出[12]。而直接进样法则对木质素遗漏较多（电子版文后支持信息表S1，S2，S3），仅检测出了一种紫丁香基木质素，并完全遗漏了对羟苯基结构的木质素单元，在其它研究报道中也发现该现象[23]。需要注意的是，由于TMAH衍生法无法區分自由羟基和既存的甲氧基，从而导致一些单宁或去甲基化合物可能被误认为木质素的产物[24]。直接进样法在脂质的检测数上比TMAH衍生法少很多，故一些研究将直接进样法与TMAH衍生法的结果相结合[25]。
两种方法检出的不同物质的含量占比也有差异。TMAH衍生法中（图2A），脂质类含量较高，超过30%，而多糖、木质素、含氮化合物、非木质素的芳香族化合物含量均在10%左右，酚类含量较低。直接进样法中（图2B），多糖含量最高（～30%），脂质、非木质素的芳香族化合物占比各约为20%，酚类占比16%，含氮化合物占比12%，而木质素类物质占比很低。TMAH衍生法中木质素、脂质含量明显高于直接进样的结果，这可能是由于木质素类和脂肪酸类的裂解产物中包含极性基团，直接进样法时这些物质很难被检出，而TMAH衍生法有效地提高了含羧基、羟基等极性基团的化合物的检出率。直接进样法检测的酚类物质含量明显高于TMAH衍生法，表明直接进样法对酚类化合物的检测更加敏感。
上述研究结果表明，相比直接进样法，TMAH衍生法检测到的标识物更多、结构更丰富，并提高了木质素和脂质的含量，能更全面地揭示土壤有机质化学组成的信息。
3.1.3?各类物质随深度、纬度分布格局的比较?用TMAH衍生法和直接进样法测得所有样品中不同土壤有机质（木质素、脂质、多糖、含氮化合物、非木质素的芳香族、酚类化合物）的变化范围如表2所示。
TMAH衍生法的结果表明，木质素含量随土壤深度增加明显减少（图3A）; 脂质含量也在大部分地区随着土壤深度增加而逐渐减少（图3B）; 除PG、YS外，含氮化合物含量也随着土壤深度增加而显著下降（图3C）; 非木质素的芳香族化合物含量则随着深度变化不显著（图3D）; 多糖含量在偏北方的4个地区（PG、HYS、BA、HZY）随着深度增加而减少，而在偏南方的3个地区（XY、HS、YS）则与深度没有显著相关性（图3E）; 酚类化合物含量随土壤深度增加而下降（图3F）。 6类物质均未呈现出随纬度的一致变化规律。
在直接进样法中，木质素类物质含量随土壤深度增加而剧烈减少（图4A），与TMAH衍生法的结果类似; 随土壤深度增加，脂质的含量减少（图4B），其下降趋势比TMAH衍生法更明显; 随土壤深度增加，含氮化合物含量增加（图4C），与TMAH衍生法的结果相反; 与TMAH衍生法的结果相似，非木质素的芳香族类物质随土壤深度的变化基本不显著（图4D）; 各地区的多糖含量都随深度变化较小（图4E）; 酚类化合物含量随土壤深度变化普遍不显著，与TMAH衍生法的结果有差异（图4F）。6类物质均没有表现出随纬度的明显分布趋势。
综上，两种方法反映出不同的土壤有机质化学组成随深度变化的规律，这些结果还需要通过更多的相关研究进一步验证。
3.1.4?不同地区土壤有机质的总体组成?图5显示了基于PLS-DA， TMAH衍生法获得深度为0～20 cm的不同地区土壤有机质的总体组成。第一主成分可以解释29%的样品信息，第二主成分可以解释13.3%的样品信息。各地区间的土壤有机质总体组成显示出明显的差异性，而相同地区重复样品的土壤有机质组成则显示出明显的一致性。偏北方的PG、HYS、BA 3个地区分布在图6的上部区域，偏中部的HZY、XY两个地区分布在中间区域，而偏南方的HS、YS两个地区则分布在下部区域，表明土壤有机质的总体组成随纬度不同而不同。
3.2?TMAH衍生法色谱出峰规律探究
本方法中，烷烃在42 min后开始被大量检出，同时， 平均每隔1.91 min，检出的烷烃会增加一个碳原子，呈良好的线性规律（R2=0.96）（图6A）。烯烃也有类似的规律。如图6B所示，单烯烃在27 min后开始被大量检出，同时， 平均每隔 1.73 min，检出的单烯烃会增加一个碳原子，呈良好的線性规律（R2=0.97）。上述两类烃类物质的色谱峰具有一定的连续性，烷烃从碳23至碳34可被连续地检出，单烯烃从碳15至碳27可被连续检出。同时，在饱和脂肪酸、含单个双键的不饱和脂肪酸两类物质中，碳原子数与保留时间也呈良好的线性规律。由图6C可见，饱和脂肪酸在30 min后开始被大量检出，同时平均每隔1.67 min，检出的脂肪酸会增加一个碳原子，呈较好的线性规律（R2=0.98）。由图6D可以看出，单不饱和脂肪酸在 16 min后开始被大量检出，同时平均每隔0.44 min，检出的脂肪酸会增加一个碳原子，呈较好的线性规律（R2=0.96）。
总之，分析结果能很好地验证KOVATs保留指数的规律，即在同样的升温条件下，正构碳数与保留时间呈线性关系[26]。结果表明，不仅是烷烃，单烯烃、饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸的正构碳数与保留时间都呈现出良好的线性关系，R2均大于0.96。
4?结 论
采用直接进样法和TMAH衍生法，对不同地区不同深度的土壤有机质进行了定性和半定量分析。相比直接进样法，TMAH衍生法检测的木质素、脂质、含氮化合物、非木质素的芳香族以及多糖等大类的标识物数目更多，结构更多样，因此该方法能够更丰富地反映土壤有机质的化学组成。两种方法获得的各类物质的百分含量随着深度和纬度的分布格局有差异。两种方法测得的木质素和脂质含量随深度变化的规律较吻合，而含氮化合物含量随深度变化的规律相反。这些结果需要更多的相关研究来验证。采用TMAH衍生法，烷烃、单烯烃、饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸的碳原子数与保留时间均呈现出良好的线性关系。
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