毛细管电泳法筛选脱铁转铁蛋白的核酸适配体及筛选影响因素分析

    杨歌 赵毅 韩诗邈 朱超 黄渊余 屈锋

    

    

    

    摘?要?核酸适配体是通过指数富集配体系统进化（SELEX）技术，在体外筛选获得的与目标分子有高亲和力与特异性的寡核苷酸序列。由于筛选过程周期长且影响因素复杂，使用常规筛选方法进行多因素影响的条件优化的工作量大，样品消耗多，目前还少有系统的研究报道。毛细管电泳（CE）具有高分辨率、快速分离、样品用量小、筛选成本低的优势，是核酸适配体筛选的有效方法。本研究以人血清中脱铁转铁蛋白（A-TF）为模式蛋白，利用CE方法研究核酸库长度、孵育温度、缓冲溶液的种类与pH值、金属离子等因素对靶蛋白与核酸库相互作用的影响。结果表明，较短序列的核酸库与靶蛋白的亲和力更高;孵育温度、缓冲液种类与pH值均影响靶蛋白与核酸复合物的形成;低浓度的K+、Ca2+与Mg2+可促进复合物形成。基于优化的筛选条件，经过3轮毛细管电泳法筛选，获得了A-TF的适配体 Seq A3，采用CE-LIF测得复合物的亲和常数KD=0.476 μmol/L。此适配体可用于人血清基质中A-TF的识别。

    关键词?脱铁转铁蛋白;核酸适配体筛选;影响因素;毛细管电泳;指数富集配体系统进化

    1?引 言

    核酸适配体（Aptamer）是通过指数富集配体系统进化（SELEX）技术体外筛选获得的寡核苷酸序列[1]，具有类似抗体的高亲和力和高特异性的优点，且稳定性好，容易制备及修饰。核酸适配体的靶标范围广，包括金属离子、小分子、蛋白质、细胞、微生物、病毒等。以蛋白质为靶标的核酸适配体筛选一直受到广泛关注，蛋白质的适配体在生物医学、药物研发、医学影像和生物检测等领域的应用已有大量报道[2～4]。由于核酸适配体筛选过程复杂，影响因素多（如蛋白的天然形态和蛋白浓度以及影响蛋白活性的溶液体系、pH值、离子、其它共存蛋白等），筛选过程的环境因素直接影响适配体的筛选效率以及适配体的实用性能，因此分析筛选适配体的影响因素，优化筛选条件，是提高筛选效率的关键问题之一。

    文献报道了通过计算生物学建立数学模型优化适配体筛选的环境参数和预测筛选结果，研究者分析了靶标浓度[5，6]、复合物与游离核酸库的分离效率[7]、靶标与核酸序列的非特异性结合[8]，以及负筛步骤等单因素对筛选效率的影响[9]。但每引入一个参数变量，计算量会巨增[10]，普通的筛选者无法使用类似的数学模型完成筛选条件的优化和预测，特别是数学模型的预测结果最终仍需大量实验结果加以验证。McKeague等[11]比较了429篇文献中的SELEX实验条件，认为靶标与孵育温度对适配体的亲和力影响最大，溶液中Mg2+浓度也有重要影响。目前，绝大多数的核酸适配体的筛选条件都是参考前期文献中的筛选条件[12～14]。实际上，不同蛋白质的性质、结构和功能不尽相同，需针对特定蛋白研究筛选环境的条件因素影响，设计针对性的筛选条件，以提高筛选效率。可能是由于常规的实验和方法系统研究多种因素的影响需要极大的工作量和样品消耗，目前还很少有较系统的研究报道。

    毛细管电泳（CE）技术具有高分辨、快速分离、样品用量小、筛选成本低的优势，是核酸适配体筛选的有效方法。本课题组长期致力于毛细管电泳筛选核酸适配体的策略和方法研究[15]，积累了大量用于蛋白质适配体筛选的毛细管电泳特征图谱，建立了多种毛细管电泳高效筛选模式，使蛋白质的核酸适配体筛选效率显著提高。转铁蛋白（Transferrin，TF）是血浆中主要的含铁蛋白，在跨膜转运中起着至关重要的作用[16]。脱铁转铁蛋白（Apo-transferrin，A-TF）是转铁蛋白的全脱铁状态，具有多种功能，如螯合游离铁将药物递送至快速生长的细胞、激活免疫细胞和防止细胞凋亡等[17，18]，但至今还没有利用CE进行核酸适配体筛选的报道。利用CE可系统研究和优化适配体的筛选条件，并进行高效筛选。本研究考察了单链核酸库（ssDNA）的序列长度、蛋白与核酸库的孵育温度、缓冲液的种类与pH值、金属离子等因素对靶蛋白与核酸序列相互作用的影响。在优化的筛选条件下，经过3轮CE-SELEX筛选，得到A-TF的适配体seq A3。此适配体对A-TF有良好的亲和力和特异性，可用于血清中的A-TF识别。

    2?实验部分

    2.1?仪器与试剂

    Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪配荧光检测器（美国Beckman-coulter公司）;MicroCal iTC200微量热等温滴定量热仪（英国马尔文仪器公司）;PICO 21低温离心机（美国赛默飞世尔科技有限公司）;?S1000TM Thermal Cycler PCR仪、凝胶电泳仪（美国BIO-RAD公司）;75 μm内径熔融石英毛细管（邯郸市鑫诺光纤色谱有限公司）。

    H3BO3、Na2B4O7、NaOH、NaCl、KCl（分析純，北京化工厂）;?NaH2PO4、Na2HPO4（国药集团化学试剂有限公司）;三羟甲基氨基甲烷（Tris）、CaCl2（天津市津科化工研究所）;A-TF、人血清白蛋白（Human serum slbumin，HSA）、人血红蛋白（Hemoglobin，HGB）（Sigma-Aldrich公司）。实验用水为二次蒸馏水（ddH2O）

    55、69、80和100 nt FAM标记ssDNA核酸库：5-FAM-AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG-（15N，29N，40N or 60N）-CCT ATG CGT GCT ACC GTG AA-3（两端为20 nt引物区，中间为随机序列）。引物P1：5-AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG-3，标记荧光的引物5-FAM-P1：FAM-5-AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG-3），引物P2：5-TTC ACG GTA GCA CGC ATA GG-3（生工生物工程（上海）股份有限公司）。2×Taq Plus PCR Master Mix、dd H2O、500 μL Nuclelc Acid Dye Gene Green、1mL 6×DNA Loading Buffer、300 μL 50 bp DNA Ladder、50 g琼脂糖（天根生化科技有限公司）。

    2.2?实验方法

    2.2.1?溶液配制?（1）毛细管电泳分离溶液?50 mmol/L硼酸硼砂缓冲液（pH 8.7）。（2）蛋白与核酸孵育溶液?1/15 mol/L Na2HPO4-KH2PO4溶液（pH 4.92、5.91、6.64、7.17、7.38、7.73、8.43、8.98）;PBS、Tris-HCl、TGK、Na2HPO4-KH2PO4缓冲液（pH 7.4）。（3）蛋白与核酸溶液?蛋白质用孵育缓冲溶液稀释。固体粉末核酸库用纯水溶解，配制成100 μmol/L的母液，于94℃变性处理5 min，然后以0.5℃/s冷卻至25℃。

    2.2.2?毛细管电泳分析条件?75 μm内径毛细管（ 50.2 cm/40 cm），使用前依次用1 mol/L NaOH、0.1 mol/L NaOH 和蒸馏水冲洗30 min进行活化;LIF检测器激发波长488 nm，发射波长520 nm;50 mmol/L硼酸盐电泳缓冲液（pH 8.7）;0.5 psi（1 psi=6.89 kPa），进样5 s;分离电压20 kV，温度25℃。

    2.2.3?PCR扩增和产物纯化?（1）PCR条件?300 nmol/L引物P1、P2各6 μL，收集模板2 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，ddH2O 11 μL。95℃预变性5 min，变性10 s，59℃退火20 s，72℃延伸30 s;循环20次后，72℃后延伸10 min。（2）PCR产物琼脂糖凝胶电泳?取RCR产物5 μL与6×DNA Loading Buffer 1 μL混合均匀后依次注入凝胶进样孔，80 V下电泳30 min，用凝胶成像分析仪拍照记录。（3）PCR产物浓缩?PCR产物于2.0 mL的离心管中，加入40 μL 3 mol/L醋酸钠溶液（pH 5.2）混匀;加入20℃预冷的900 μL无水乙醇混匀，15000 r/min离心15 min;加入70%乙醇洗涤沉淀，弃乙醇，沉淀干燥;（4）PCR产物回收?切下琼脂糖凝胶电泳上所需条带，转入1.5 mL离心管中，离心后于20℃冰冻20 min，捣碎;加入500 μL ddH2O，振摇多次;加入500 μL Tris饱和纯苯酚，振摇后离心;取新离心管，加入500 μL 氯仿-异戊醇（24∶1，V/V），再加入上清液，振摇后离心;取新离心管，加入无水乙醇900 μL、 3 mol/L醋酸钠20 μL，加入上清液后混匀，离心，弃去上清液，沉淀物于室温风干。

    2.2.4?序列分析与亲和力表征?高通量测序由生工生物公司完成，使用DNAman软件分析序列二级结构。CE法计算核酸序列与蛋白的结合比。利用GraphPad Prism 6 软件按1∶1模型，拟合非线性饱和曲线，计算平衡解离常数（Dissociation constant，KD）。

    2.2.5?CE法验证亲和力与特异性?将筛选的核酸适配体序列加入含有A-TF（0.1～2 μmol/L）的人血清50倍稀释液样本中，37℃孵育20 min。以CE-LIF检测复合物，计算适配体序列与A-TF的结合比，利用Origin 2018软件，对结合百分比随A-TF浓度变化拟合非线性饱和曲线，计算KD。相同条件下，将核酸适配体序列分别与HSA、HGB孵育，利用CE-LIF分析核酸适配体的特异性。

    3?结果与讨论

    3.1?不同长度随机序列的核酸库与蛋白A-TF和HSA的结合分析

    目前报道的筛选用核酸库的随机序列含碱基数最短22 nt[19]，最长200 nt[20]，应用最普遍的是40～70 nt[11]。Velez等[21]验证了核酸酶对不同长度核酸序列的催化活性，但有关核酸库序列长度对靶标复合物形成和适配体筛选的影响还没有系统的研究报道，而通过CE电泳图可评价不同长度核酸库与A-TF结合的差异，分析核酸库长度对A-TF-核酸复合物形成的影响。图1为A-TF分别与4个不同随机序列长度（60、40、29和15 nt）核酸库ssDNAN60、ssDNAN40、ssDNAN29、ssDNAN15孵育后的混合物的电泳图。与初始ssDNAN60核酸库峰高相比，加入A-TF后，4.6 min处的ssDNAN60核酸库峰高没有明显降低，也没有明显的复合物峰出现。ssDNAN40的结果与ssDNAN60相似。但更短的核酸库 ssDNAN29、ssDNAN15与A-TF混合物的电泳图中，可见核酸库峰高有明显降低，且3～4 min区间有明显的复合物包峰，其随A-TF浓度增加而增大。以HSA蛋白为对照蛋白，将A-TF换成HSA蛋白，结果与A-TF相似（图1B）。两种蛋白均与短序列的核酸库有结合，使核酸库峰降低并形成较明显的复合物峰，说明较短的核酸库中存在较多可与两种靶蛋白结合的序列，它们分别形成A-TF-ssDNA复合物和HSA-ssDNA复合物。目前大量的筛选实验均使用ssDNAN60或ssDNAN40，但并未有选择依据的说明或研究。从CE电泳图可见，核酸库长度对复合物的形成有明显影响，说明不同序列长度的核酸库对蛋白的结合能力有所不同，但是否会影响最佳适配体的筛选目前并无报道。根据此前的研究结果，适配体筛选前应对核酸库长与蛋白靶标的结合进行评估，以优选核酸库和其它筛选条件。考虑到评估的效率和成本，CE无疑是最佳方法。本实验以长度居中的随机序列长度29 nt（研究最充分的人凝血酶的适配体的长度），总长度69 nt的ssDNAN29核酸库研究适配体筛选的影响因素。

    3.2?孵育温度对A-TF-ssDNA和HSA-ssDNA 复合物形成的影响

    单链核酸具有很大的柔性，其结构易受环境因素影响，如溶液温度会显著影响其二级和三级结构，也影响其与靶标的结合能力。适配体筛选前需要对核酸库进行高温变性和低温复性，以保持其稳定的结构并能与蛋白结合。孵育温度不仅影响筛选过程中靶标与核酸的结合，也影响实际应用中适配体对靶标的识别效果，因此筛选适配体时必须考虑孵育温度的影响。文献报道中常用的孵育温度为4℃、25℃和37℃。4℃时大部分的细胞或蛋白可保持活性[22，23];25℃是室温条件[24，25]，是常规实验用温度;37℃则是生理温度[26，27]。考察了3种孵育温度对两种蛋白的复合物形成的影响。由图2A可见，随孵育温度升高，A-TF-ssDNA复合物峰明显增加，37℃形成的复合物最多。HSA復合物形成情况相似。因此，温度变化对适配体与蛋白的结合影响很大。筛选适配体的温度条件与应用适配体的温度条件如果不一致，可能会使适配体因结构变化而导致亲和力弱化甚至丧失，CE分析结果为此提供了参考。目前很多文献报道的适配体，在应用时效果不佳甚至没有亲和力，部分原因可能是筛选条件和应用环境的不一致，包括筛选和应用时不同温度的影响。

    3.3?缓冲溶液组成和pH值对A-TF-ssDNA复合物形成的影响

    蛋白与核酸库孵育的缓冲溶液及pH值也影响复合物的形成。缓冲溶液和pH的选择并没有明确的标准和依据，筛选者所用溶液条件多参考前期的文献[28]。常用缓冲溶液有PBS、Tris-HCl、TGK、Na2HPO4-KH2PO4等，分别在这些溶液中将A-TF与ssDNA混合孵育。由图3A可见，在Na2HPO4-KH2PO4中，A-TF与核酸形成明显的复合物包峰，其它3种溶液中则未检出复合物峰。改变Na2HPO4-KH2PO4溶液的pH值 （pH 4.92～8.98），该复合物峰无明显变化（图3B），说明此缓冲液中，pH值对A-TF与核酸的结合影响较小，表明A-TF与ssDNA库孵育可选用的溶液pH范围很宽，有利于适配体的筛选和实际应用。

    3.4?金属离子对A-TF-ssDNA复合物形成的影响

    溶液中一定浓度的阳离子可以稳定核酸的二级结构[29]，中和ssDNA骨架上的负电荷，排除其与蛋白质的静电作用，但也可能影响蛋白质的荷电性和二级或三级结构，继而影响蛋白与ssDNA的结合[24]。已有报道，金属离子对蛋白与ssDNA的结合有明显的影响[30]，但系统的研究方法和报道不多。目前报道的适配体筛选溶液中，通常含有Na+、K+、Ca2+、Mg2+或几种阳离子的组合。K+、Ca2+、Mg2+浓度为1～5 mmol/L[31，32]，Na+浓度为2～150 mmol/L[33～35]。比较了溶液中K+、Ca2+与Mg2+对A-TF-ssDNA 复合物形成的影响。由图4A可见，溶液中K+为0～1 mmol/L时，电泳图中有复合物峰。K+大于10 mmol/L，复合物包峰消失。溶液中含1 mmol/L Ca2+与1 mmol/L K+相似，但含10～50 mmol/L Ca2+时，复合物峰几乎消失，而含100～150 mmol/L Ca2+时，又出现更大的复合物峰（图4B），说明不同浓度的Ca2+对复合物形成的影响不同。推测是由于高浓度的Ca2+ 可能影响A-TF或核酸的二级结构，但具体原因还需进一步探讨。而Mg2+浓度的影响与K+非常相似（图4C），与同为二价的Ca2+的影响有明显差异。CE的分析结果表明，筛选中使用1～5 mmol/L K+、Ca2+、Mg2+可促进复合物的形成。由于CE的背景缓冲液为50 mmol/L硼酸硼砂缓冲液（pH 8.7），含有50 mmol/L Na+，故分离过程中也可保持一定的离子浓度。上述结果也表明，不同的蛋白质筛选适配体时，筛选溶液中的金属离子对蛋白与核酸结合的影响可能存在很大差异，筛选时应考虑溶液中离子种类和强度的影响。此外，在不同的实际样品环境中，阳离子类型和浓度复杂多变，所筛选的适配体的结构可能受其影响而改变，进而影响适配体与靶蛋白的结合。因此，适配体在应用时如果效果不佳，甚至没有亲和力，离子种类和强度可能也是影响原因之一。

    3.5?分析电压和温度对复合物分离的影响

    对蛋白与核酸库孵育的混合物进行CE分析，可根据CE电泳图谱快速、直观地评估蛋白-ssDNA复合物的形成及定性评价结合强弱。进一步考察了电泳分离过程中分离电压和分离温度对复合物稳定性的影响。以50 mmol/L硼酸硼砂缓冲液（pH 8.7）为背景溶液，改变分离温度（15℃～45℃）和分离电压（15～30 kV），比较复合物峰的变化。当分离温度由15℃逐渐增加至45℃，ssDNA和复合物的迁移速度明显加快，迁移时间明显缩短，且二者的峰形尖锐，柱效明显提高。在30℃～45℃分离温度下，复合物的峰面积保持不变，说明A-TF-ssDNA复合物稳定，结果与孵育温度37℃形成的复合物最多一致。增加分离电压也可加快分离速度，30 kV电压可使复合物的迁移时间缩短到2 min。因此，在优化的溶液条件下，使用较高的分离温度（35℃～37℃）和较高电压可加快复合物的分离速度，节省分离时间。

    3.6?A-TF的核酸适配体筛选

    在优化的CE条件下（缓冲液10 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4，pH 7.17，含0.1 mmol/L Mg2+，37℃孵育10 min），用总长为69 nt的ssDNAN29核酸库筛选A-TF的核酸适配体。第1轮筛选用10 μmol/L A-TF与1 μmol/L ssDNAN29库混合孵育。收集复合物，经不对称PCR扩增，ssDNA纯化，得到次级库（Sub1-ssDNA）用于第2轮筛选。第2轮筛选用5 μmol/L A-TF与Sub1-ssDNA次级库混合。其CE结果见图6A。3.8～5.4 min区间有复合物峰，收集复合物进行PCR扩增，产物的凝胶电泳如图6A右图所示。由于ssDNAN29样品的模板浓度过高，其PCR产物条带弥散，而扩增产物R2条带长度在50～100 bp之间，为目标产物。切胶回收纯化后，获得了新的次级库Sub2-ssDNA，用于第3轮筛选。第3轮筛选用2.5 μmol/L A-TF与Sub2-ssDNA次级库混合。如图6B所示，3.6～5.2 min区间为复合物峰。收集复合物进行PCR扩增，产物的凝胶电泳如图6B右图所示，其中R3为PCR扩增产物，而扩增产物R3条带长度在50～100 bp之间，为目标产物。

    將第3轮筛选得到的PCR产物进行高通量测序。选择出现频数最高的3条序列Seq A1～Seq A3，用M-fold模拟序列的二级结构，结果显示，这些序列普遍呈茎环结构（图7A）。对3条序列Seq A1、Seq A2、Seq A3用 CE方法表征亲和力

    并计算其复合物的KD值。根据A-TF与3条序列的结合百分比，用1∶1结合模型做线性拟合，得到Seq A1、Seq A2、Seq A3的KD值分别为3.338、1.550和0.476 μmol/L（图7B）。选亲和力最高的Seq A3为其适配体。

    3.7?Seq A3用于血清中A-TF的特异性识别和检测

    A-TF为血清蛋白，HSA、HBG也是血清中高丰度蛋白，故在血清样品中验证Seq A3对A-TF的高亲和和特异性识别。在3份稀释50倍的人血清样品中分别加入1 μmol/L的A-TF、HSA和HBG，得到3个加标的血清稀释样品。分别将0.2 μmol/L的Seq A3加入3个样品，在37℃孵育20 min，用CE-LIF分析。由图8A可见，Seq A3可与含A-TF的样品形成明显的复合物（PA），而含HSA和HBG的样品中未见明显的复合物峰，说明在稀释的血清基质中，Seq A3对A-TF有特异性的识别。分别在稀释血清中加入0.1，0.2，0.5，1，2，5 μmol/L A-TF，将0.2 μmol/L Seq A3作为荧光探针与其混合。随着A-TF浓度的增加，游离Seq A3峰降低，而复合物（PA）峰增加（图8B），加入A-TF的浓度与Seq A3峰的降低百分比呈线性关系（图8C）。说明筛选的Seq A3可识别血清中的A-TF，其用于实际检测还需进一步深入研究。

    4?结 论

    核酸适配体筛选过程复杂，影响筛选的因素很多。分析筛选因素的影响，优化筛选条件，是提高筛选效率的关键。毛细管电泳是直观、快速、优化筛选条件的有效方法。基于毛细管电泳方法可系统研究核酸库随机序列长度、蛋白与核酸库的孵育温度、缓冲液种类与pH值、金属离子等因素对靶蛋白与核酸序列相互作用的影响，并可用于筛选条件优化。毛细管电泳方法较常规筛选方法大大减少了工作量和研究成本，可用于蛋白质靶标的适配体筛选条件研究，方法具有普适性。A-TF是重要的生物功能蛋白，其核酸适配体Seq-A3可以选择性识别人血清基质中的A-TF。

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