雪莲细胞培养物的质量标准研究
张敏 张雪松 刘雅萍
摘要 目的：建立雪蓮细胞培养物的质量标准。方法：参照《中华人民共和国药典》2020年版附录，分别建立雪莲细胞培养物的一般检查项目及定性定量指标。以芦丁为对照品，利用紫外分光光度法建立雪莲细胞培养物总黄酮成分含量的测定方法;利用高效液相色谱（HPLC）法同时测定绿原酸、紫丁香苷和1，5-二咖啡酰奎尼酸成分含量，并建立其特征图谱，采用2012版《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》对特征图谱进行相似度分析。结果：15批次雪莲细胞培养物总黄酮类成分含量10.0%～11.0%;绿原酸含量0.86%～1.09%;紫丁香苷含量0.34%～0.48%;1，5-二咖啡酰奎尼酸含量3.20%～3.75%。15批雪莲细胞培养物指纹图谱相似度大于0.9，特征图谱中呈现10个特征峰，指认峰2为绿原酸、峰4为紫丁香苷、峰7为1，5-二咖啡酰奎尼酸。结论：本研究建立了雪莲细胞培养物的质量标准，建议醇溶性浸出物不得低于29.4%;雪莲细胞培养物中的总黄酮类成分含量不得低于10.0%，绿原酸、紫丁香苷、1，5-二咖啡酰奎尼酸的含量应分别不得低于0.86%、0.34%、3.20%，为天山雪莲药制品的工业化生产提供了参考。
关键词 雪莲细胞培养物;定性定量;总黄酮;绿原酸;紫丁香苷;1，5-二咖啡酰奎尼酸;特征图谱;质量标准
Abstract Objective：To establish the quality standard of Saussurea involucrata cell cultures.Methods：According to the appendix of Chinese Pharmacopoeia （2020 edition），the general examination items and qualitative and quantitative indexes of S.involucrata cell cultures were established.The content of total flavonoids in Saussurea involucrata cell culture was determined by ultraviolet spectrophotometry with rutin as the control substance; the content of chlorogenic acid，syringin and 1，5-dicaffeoylquinic acid was determined by HPLC simultaneously，and the characteristic chromatogram was established.The similarity of characteristic chromatogram was analyzed by the software Chinese Medicine Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation system（2012 edition）.Results：The total flavonoid content of 15 batches of S.involucrata cell cultures was between 10.0% and 11.0%; the content of chlorogenic acid was between 0.86% and 1.09%; the content of syringin was between 0.34% and 0.48%; 1，5-The content of dicaffeoylquinic acid was between 3.20% and 3.75%.The similarity of fingerprint patterns of 15 batches of S.involucrata cell cultures was greater than 0.9，and there were 10 characteristic peaks in the characteristic pattern.Peak 2 was chlorogenic acid，peak 4 was syringin，and peak 7 was 1，5-dicaffeoylquinic acid.Conclusion：In this study，the quality standard of S.involucrata cell cultures is established，and it is suggested that the alcohol soluble extract should not be less than 29.4%; the content of total flavonoids in S.involucrata cell cultures should not be less than 10.0%，and the content of chlorogenic acid，syringin and 1，5-dicaffeoylquinic acid should not be less than 0.86%，0.34% and 3.20%，respectively，which provides a reference for the industrial production of S.involucrata medicinal products.
Keywords Cell cultures of Saussurea involucrata; Qualitative and quantitative indicators; Total flavonoids; Chlorogenic acid; Syringin; 1，5-dicaffeoylquinic acid; Characteristic chromatogram; Quality standard
中图分类号：R284.1文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.07.001
天山雪莲[Saussurea involucrate（Kar.et Kir.）Sch.Bip]又称雪莲、雪莲花、新疆雪莲，为菊科风毛菊属多年生草本植物，主要分布于新疆天山、昆仑山及阿尔泰山区终年积雪不化的地带，是一种高山稀有的名贵药用植物[1]。其入药始载于公元8世纪的藏药典《月王药诊》，并在之后多部著名医药典籍中出现，如《四部医典》《本草纲目拾遗》等，至今已有上千年的用药历史。天山雪莲具有活血通经、散寒除湿、强筋助阳的功效[2]，汉族人民多视其为治疗风湿关节炎之珍品，维吾尔族、哈萨克族则将其作为治疗痛经、月经不调的妇科良药，故民间有“东北人参，新疆雪莲”之说。现代研究表明，天山雪莲主含黄酮类、倍半萜类、香豆素类、生物碱类等活性成分，具有抗炎镇痛、抗疲劳、抗衰老等作用[3]，其对人体的调理保健作用受到普遍关注。
由于天山雪莲生长环境独特，生长周期长，人工栽培困难，加之乱采滥挖，过度开发，野生资源濒临灭绝，已被列为国家二级濒危植物，难以满足日益增长的市场需求。而在人工控制的条件下，对天山雪莲进行细胞培养，可在短时间内获取大量细胞产物，并能保证产品质量稳定、药效成分高，实现大规模工业化生产，从而解决雪莲药材短缺的问题[4-6]。有研究表明，雪莲细胞培养物与野生植株存在相似的化学成分及药效，富含黄酮类化合物，且绿原酸、紫丁香苷和1，5-二咖啡酰奎尼酸的含量远高于天然植物，具有重要的应用价值[7-8]。目前，已有大量以雪莲细胞培养物为原料的营养保健品上市[9-10]。鉴于雪莲细胞培养物与植物在生长周期、生长环境及外观性状等方面存在明显差异，需针对其特点进行质量研究。
我们首次对雪莲细胞培养物的水分、灰分、酸不溶性灰分及醇溶性浸出物进行测定，并以芦丁为对照，建立紫外分光光度法测定总黄酮成分含量，建立高效液相色谱（HPLC）法同时测定绿原酸、紫丁香苷和1，5-二咖啡酰奎尼酸成分含量，并在此基础上规定其活性成分的含量限度，同时建立对照特征图谱，为雪蓮培养物的质量控制提供参考。
1 仪器与试药
1.1 仪器
紫外分光光度计（岛津企业管理有限公司，型号：UV-1900I）;高效液相色谱仪（安捷伦科技公司，美国，型号：Agilent 1260）;色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）（安捷伦科技公司，美国，型号：Agilent ODS C18）;电子天平（上海精科天美仪器有限公司，型号：FA2204B）。
1.2 试剂
甲醇（色谱级，Merck，德国，批号：JA090530）;乙腈（色谱级，Spectrum Chemical，美国，批号：3IA0017）;其他试剂均为分析纯，水为去离子水。芦丁标准品（纯度98%，北京北纳创联生物技术研究院，批号：153-18-4）;绿原酸标准品（纯度98%，中国药品生物制品检定所，批号：110753-200413）;紫丁香苷标准品（纯度98%，中国药品生物制品检定所，批号：111574-200205）;1，5-二咖啡酰奎尼酸标准品（纯度98%，北京北纳创联生物技术研究院，批号：19040105）。
1.3 分析样品
15批雪莲培养物由大连普瑞康生物技术有限公司提供，以野生天山雪莲[S.involucrate（Kar.et Kir.）Sch.Bip.]的种子萌发的无菌叶片为种源，诱导产生愈伤组织进行继代培养，即得紫红色团状细胞培养物，编号S1～S15。
2 方法与结果
2.1 雪莲培养物的水分、灰分和酸不溶性灰分测定
按照《中华人民共和国药典》（2020年版）（以下简称《药典》）通则0832第二法测定雪莲培养物中的水分：含水量为4.6%～7.0%。按照《药典》通则2302测定雪莲培养物中的总灰分：总灰分为7.0%～9.8%。按照《药典》通则2302测定雪莲培养物中的酸不溶性灰分：酸不溶性灰分为0.15%～0.23%。具体结果见表1。
2.2 雪莲培养物中浸出物测定
根据《药典》通则2201醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定，以70%乙醇作溶剂，对雪莲培养物的浸出物进行检查，得浸出物含量为29.40%～32.40%，平均浸出物为30.94%。具体结果见表1。
2.3 雪莲培养物中总黄酮成分含量测定
2.3.1 对照品溶液的制备
取芦丁对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每1 mL含芦丁0.4 mg的溶液，作为对照品溶液。
2.3.2 供试品溶液的制备
取本品0.1 g，精密称定，加甲醇适量，超声处理30 min，放冷，转移至50 mL容量瓶，定容，摇匀。并按亚硝酸钠-硝酸铝法[11]进行处理。
2.3.3 线性关系考察
分别精密量取对照品溶液1、2、3、4、5、6 mL，置25 mL量瓶中，加水至6.0 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀后静置6 min;加10%硝酸铝溶液1 mL，混匀后静置6 min;加4%氢氧化钠溶液10 mL，加蒸馏水定容至刻度，混匀后在510 nm波长处测定吸光度。以吸光度（A）为纵坐标，浓度（μg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程y=80.912x-0.109 3，R2=0.999 9。
2.3.4 精密度试验
取对照品溶液，连续测定6次。测定其吸光度，得到RSD值为0.09%，表明精密度良好。
2.3.5 中间精密度试验
不同实验人员进行“2.3.4”项下试验。测定其吸光度，得到RSD值为1.04%，表明中间精密度良好。
2.3.6 稳定性试验
取3组供试品溶液，分别于0 h、0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h时进行测定，计算3组总黄酮类成分的RSD值分别为0.81%、0.73%和0.67%，说明供试品溶液3 h内稳定。
2.3.7 重复性试验
精密称取雪莲培养物0.1 g共6份，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液。测定其吸光度，得到RSD值为0.80%，表明本方法重复性良好。
2.3.8 回收率试验
取雪莲培养物0.05 g与定量的芦丁对照品溶液混合进行超声提取，制备供试品溶液。平行6次，测定总黄酮含量，计算方法的回收率为99.60%，RSD%为1.42%，表明方法的准确度较好。
2.3.9 样品测定结果
取各批次雪莲细胞培养物，测定总黄酮含量。测得雪莲总黄酮含量为10.0%～11.0%，平均值为10.33%。见表2。
2.4 雪莲培养物中绿原酸、紫丁香苷、1，5-二咖啡酰奎尼酸含量的测定
2.4.1 色谱条件
安捷伦1200液相系統，Agilent ODS C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;以乙腈流动相为A，以0.02M磷酸二氢钾溶液为流动相B，梯度洗脱（0～20 min，8%～10% A;20～50 min，10%～30% A）;柱温30 ℃;流速为1.0 mL/min;检测波长265 nm;进样量为20 μL。
2.4.2 对照品溶液的制备
取绿原酸、紫丁香苷、1，5-二咖啡酰奎尼酸标准品适量，加10%乙腈溶液，配制含量分别为0.01 mg/mL、0.005 mg/mL、0.025 mg/mL的混合标准品溶液。
2.4.3 供试品溶液的制备
取本品0.1 g，加10%乙腈水溶液100 mL，超声提取30 min，取上清液过滤膜，待测。
2.4.4 专属性试验
精密量取供试品溶液、混合对照品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，按2.4.1色谱条件下进样检测，结果见图1。结果表明，本方法可正确检测绿原酸、紫丁香苷、1，5-二咖啡酰奎尼酸色谱峰，专属性良好。
2.4.5 线性关系考察
取标准品溶液，在进样量分别为4 μL、10 μL、16 μL、20 μL、40 μL、60 μL条件下测定峰面积，折算进样量20 μL进行测定。以质量浓度（μg/mL）为纵坐标，峰面积（AU×S）为横坐标，绘制各成分标准曲线。绿原酸y=0.069 18x+0.098 47（R2=1），线性范围为2.3～34.5 μg/mL;紫丁香苷y=0.021 30x+0.006 75（R2=1），线性范围为0.992～14.88 μg/mL;1，5-二咖啡酰奎尼酸y=0.063 82x+0.085 31（R2=1），线性范围为5.0～75.0 μg/mL。
2.4.6 精密度试验
取绿原酸、紫丁香苷和1，5-二咖啡酰奎尼酸混合对照品，连续测定6次。计算峰面积RSD，得到RSD值分别为0.16%、0.77%和0.11%，说明精密度良好。
2.4.7 中间精密度试验
不同研究人员采用不同仪器取同一批次样品0.1 g，按照“2.4.3”项下制备供试品溶液，进样测定，得到中间精密度RSD值分别为0.36%、1.01%、1.20%，表明中间精密度良好。
2.4.8 稳定性试验
取雪莲培养物0.1 g，按2.4.3制备供试品溶液，分别在0、1、2、3、4、5 h进样。计算峰面积RSD值小于2%，结果表明，供试品溶液在5 h内稳定性良好。
2.4.9 重复性试验
按“2.4.6”项下方法，计算对照品溶液中绿原酸、紫丁香苷和1，5-二咖啡酰奎尼酸的峰面积，得到RSD值分别为1.04%、0.91%和0.73%，说明方法的重复性良好。
2.4.10 回收率试验
精密称定雪莲培养物0.05 g，定量加入一定浓度的混合标准品溶液，制备供试品溶液，平行六次测定，得到绿原酸、紫丁香苷和1，5-二咖啡酰奎尼酸回收率均值分别为101.97%、100.18%、100.66%，RSD值分别为1.68%、1.76%、2.44%。1，5-二咖啡酰奎尼酸回收率的RSD值偏大，推测与1，5-二咖啡酰奎尼酸稳定性有关，其样品溶液配制时间过长导致含量降低，回收率测定结果偏差较大。
2.4.11 样品测定结果
取15个批次的雪莲细胞培养物，进行含量测定，得到绿原酸、紫丁香苷和1，5-二咖啡酰奎尼酸平均含量分别为0.99%、0.38%、3.45%，RSD值分别为6.01%、10.37%、5.03%。见表3。
2.5 特征图谱的建立
2.5.1 供试品溶液的制备 同“2.4.3”项下。
2.5.2 对照品参照物溶液的制备 同“2.4.2”项下。
2.5.3 色谱条件建立 同“2.4.1”项下。
2.5.4 精密度试验
取雪莲培养物样品，按“2.5.1”项下制备供试品溶液，按“2.5.3”项下色谱条件方法，连续进样6次。以紫丁香苷峰为参照峰S，计算各共有峰的相对保留时间。结果各色谱峰相对保留时间RSD为0.31%～1.59%，表明精密度良好。
2.5.5 稳定性试验
取雪莲培养物样品，按“2.5.1”项下制备供试品溶液，按“2.5.3”项下色谱条件方法，连续进样6次。以紫丁香苷峰为参照峰S，计算各共有峰的相对保留时间。结果各色谱峰相对保留时间RSD为0.16%～1.21%，表明稳定性良好。
2.5.6 重复性试验
取雪莲培养物样品，平行6份，按“2.5.1”项下制备供试品溶液，按“2.5.3”项下色谱条件方法，进样测定。以紫丁香苷峰为参照峰S，计算各共有峰的相对保留时间。结果各色谱峰相对保留时间RSD为0.18%～1.55%，表明重复性良好。
2.5.7 对照特征图谱的建立
取15批雪莲培养物，按“2.5.1”项下制备供试品溶液，按“2.5.3”项下色谱条件方法进样检测。采用2012版《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件对15批雪莲细胞培养物色谱峰进行校正，以中位数法生成对照特征图谱（R），确立10个共有特征峰。见图2。与对照品比对，指认其中峰2为绿原酸、峰4为紫丁香苷、峰7为1，5-二咖啡酰奎尼酸。见图3。15批次雪莲培养物与对照特征图谱的相似度均大于0.9，表明各批次的雪莲培养物质量一致性较好。见表4。
3 讨论
天山雪莲是典型的珍稀濒危药用植物，市场上价格高、需求量大，植物细胞培养是解决供需矛盾的有效途径[12]。20世纪90年代开始，就出现雪莲组织培养的相关报道[13-14]。以野生天山雪莲种子萌发后的无菌苗叶片为原料，在培养基进行诱导产生愈伤组织，经继代培养产生稳定的天山雪莲细胞系，筛选高产细胞系，在特定条件下培养，即可获得雪莲细胞培養物。在不同培养条件下，天山雪莲愈伤组织的形态及次生代谢产物存在明显差异，其中，以在MS培养基上诱导产生的紫红色团粒状的愈伤组织生长旺盛，且总黄酮类成分含量高[15-16]。
2010年，原卫生部批准雪莲培养物为植物类新资源食品，对其性状（鲜品：紫红色团块颗粒;干品：紫灰色粉末）、蛋白质含量（鲜品：≥1%;干品：≥7%）、总黄酮含量（鲜品≥0.4%;干品：≥7%）均做要求，可应用于生产保健食品[17]。但至今尚未有雪莲培养物的药用标准。雪莲细胞培养物中除与原植物药材相似富含以芦丁为主的黄酮类成分，其绿原酸、紫丁香苷和1，5-二咖啡酰奎尼酸的含量也很高[18-19]，可达到培养物干重的0.862%、3.20%、0.335%，远高于原植物药材。绿原酸具有抗炎、抗高血糖和抗乙型肝炎病毒的作用，是众多药材抗菌解毒、消炎利胆的主要成分[20];紫丁香苷具有抗炎镇痛、抗高血糖、抗抑郁、抗肿瘤活性，在《中华人民共和国药典》中是天山雪莲、刺五加等药材及相关制剂的定性和定量指标[21];1，5-二咖啡酰奎尼酸具有良好的抗氧化、治疗糖尿病和抗艾滋病的作用[22]。与原植物药材相比，雪莲细胞培养物具有更强的抗氧化和抗病毒活性。故本研究选择总黄酮成分及绿原酸、1，5-二咖啡酰奎尼酸和紫丁香苷成分含量为定量指标，对天山雪莲培养物进行质量研究。
本研究以15批次天山雪莲细胞培养物为研究对象，测定指标成分总黄酮类及绿原酸、1，5-二咖啡酰奎尼酸和紫丁香苷成分的含量，建立相应的含量测定方法及特征指纹图谱，且方法学考察符合要求，可全面反映雪莲细胞培养物化学组分信息，为雪莲细胞培养物的质控和评价提供参考。
参考文献
[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，2002：35.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2020：55-56.
[3]尹辉.雪莲化学成分、药理活性及临床应用研究[J].齐齐哈尔医学院学报，2013，34（7）：1010-1012.
[4]荆甜蕊，徐思雅，倪亦飞，等.天山雪莲生物技术研究进展[J].基因组学与应用生物学，2016，35（8）：2201-2210.
[5]刘晓鹏，王锋，赵黎明，等.药用植物组织培养研究进展[J].湖北民族学院学报：自然科学版，2019，37（1）：13-18.
[6]贾丽华，郭雄飞，贾晓光，等.天山雪莲的开发与应用[J].新疆中医药，2016，34（1）：126-128.
[7]邹晓伟.雪莲细胞培养物成分及新型循环色谱的研究[D].大连：大连理工大学，2014.
[8]刘雅萍.雪莲培养物的抗辐射抗疲劳抗氧化功能评价[D].大连：大连理工大学，2012.
[9]廉翠翠，查圣华，王俊亮，等.雪莲培养物保健食品的抗氧化功能研究[J].食品研究与开发，2020，41（13）：43-49.
[10]杨梦楠，赵晓枚.雪莲培养物红景天胶囊的保健功效综述[J].科技资讯，2018，16（27）：224-226.
[11]付婉艺，李厚华，李玲，等.天山雪莲悬浮培养细胞总黄酮提取纯化工艺研究[J].西北农林科技大学学报：自然科学版，2013，41（8）：175-181.
[12]王娟，李金鑫，李建丽，等.植物组织培养技术在中药资源中的应用[J].中国中药杂志，2017，42（12）：2236-2246.
[13]赵德修，乔传令，汪沂.水母雪莲的细胞培养和高产黄酮细胞系的筛选[J].植物学报，1998，16（6）：3-5.
[14]赵德修，赵敬芳.水母雪莲的细胞培养[J].应用基础与工程科学学报，1997，5（4）：363-368.
[15]贾景明，吴春福，吴立军，等.天山雪莲愈伤组织培养与次生代谢物形成的研究[J].中药研究与信息，2005，7（7）：11-15.
[16]丁黛灵，陈芸，魏炯河，等.天山雪莲组织培养体系的优化[J].甘肃农业科技，2019，57（6）：25-29.
[17]中华人民共和国卫生部公告2010年第9号[J].中国食品卫生杂志，2010，22（4）：380.
[18]李燕，郭顺星，王春兰，等.天山雪莲细胞培养物与原药材中紫丁香苷含量的比较[J].中国药学杂志，2008，43（10）：737-739.
[19]陈日道，刘晓，邹建华，等.天山雪莲悬浮培养细胞中紫丁香苷、绿原酸和1，5-二咖啡酰奎尼酸的生物合成调控[J].中国中药杂志，2014，39（12）：2275-2280.
[20]严永旺，肖兰，周旭，等.绿原酸的药理作用及药用研发对策[J].中国药房，2017，28（19）：2729-2732.
[21]汪琢，姜守刚，祖元刚，等.刺五加中紫丁香苷的提取分离及抗肿瘤作用研究[J].时珍国医国药，2010，21（3）：752-753.
[22]赵昱，赵军，李湘萍，等.咖啡酰奎尼酸类化合物研究进展[J].中国中药杂志，2006，31（11）：869-874.
（2021-03-05收稿 责任编辑：徐颖）
