尤斯灌流技术在肠道营养物质转运中的研究进展
孙飞+方热军
（湖南农业大学动物科学技术学院湖南·长沙410128）
摘要：尤斯灌流技术被誉为肠道屏障功能研究的金标准，关于尤斯灌流系统在肠道屏障功能研究已成为热点，但有关尤斯灌流技术在营养物质转运方面的研究还很匮乏，本文对尤斯灌流室的基本原理和构造作简要综述，并综合国内外学者的研究进展，总结了尤斯灌流技术在肠道营养物质转运研究中的应用。
关键词：尤斯灌流；肠上皮组织；营养物质；转运
1951年，丹麦学者Hans Ussing在对上皮组织离子转运的研究中，首次将Ussing chamber（尤斯室，Ussing灌流室）介绍于世，其主要功能是利用微电极检测整个细胞膜离子通道变化的电流信号，来反映肠道药物吸收、通透性和分泌情况的变化。近些年来，关于尤斯灌流系统在肠道粘膜屏障功能研究已成为热点，但尤斯灌流系统在肠道营养物质转运中的研究或许可以为养殖生产带来更实际的帮助。
尤斯灌流系统的基本构造
尤斯灌流系统主要由灌流室、电路系统、数据采集系统、恒温装置以及配套系统组成。常见的灌流室有2、4、6和8室4种类型。根据工艺不同可将其分为持续式和循环式灌流室。持续式灌流室包括2个溶液贮器，通过聚乙烯管道将溶液引入2个半室，并设阀门控制流速。循环式灌流室由1个U形管道和2个半室组成，2个半室中间是1个用于嵌合组织样本且可移动的滑块，它可以有效降低灌流过程中上皮组织所受到的损伤。
上皮组织由密集排列的上皮细胞和少量细胞间质组成，具有极性和紧密连接，这也是区别于其他组织的两大特征。极性是因为细胞游离面（或顶面）和基底面结构和功能的分布不均造成的；而紧密连接又称闭锁小带，常见于单层柱状上皮和单层立方上皮中，位于相邻细胞间隙的顶端侧面，紧密连接除具机械连接作用外，更重要的是封闭细胞间隙，阻止细胞外的大分子物质经细胞间隙进入组织内。紧密连接的形状和渗透性决定上皮组织的完整性以及对物质的阻抗力。
尤斯灌流系统在肠道营养物质转运中的研究
经食道而来的物质在胃和小肠内被降解为葡萄糖、小肽、游离脂肪酸和氨基酸等物质，通过胃肠道上皮细胞基顶膜转运载体进入胃肠壁内，再通过基底膜转运载体转出，进入血液循环供肠道和其他组织利用。提高畜禽胃肠道上皮细胞的分泌作用对营养物质的吸收转运效率对于减少饲养成本，促进动物生长具有重要意义。应用尤斯灌流技术研究营养物质在肠道中的转运主要集中在葡萄糖、氨基酸以及矿物质的转运方面。
葡萄糖是自然界分布最广且最为重要的一种单糖，是生物体内新陈代谢不可缺少的营养物质，其主要消化部位在小肠。因此，研究肠道上皮对葡萄糖的转运效率至关重要。葡萄糖经肠道上皮细胞顶膜Na+-葡萄糖-载体蛋白主动转运进入细胞，并由基底膜葡萄糖转运载体转运进入血液。葡萄糖转运过程中Na+跨膜转运产生的离子电流，为Ussing chamber技术在葡萄糖转运研究中的应用创造了条件，并以Isc的变化反映葡萄糖的转运规律。Millar等利用Ussing chamber研究表皮生长因子（EGF）对兔空肠葡萄糖转运的影响，其结果表明EGF通过PKC和PI3-激酶途径促进3-O-甲基葡萄糖的转运。Gar-cia-Amado等利用Ussing chamber技术研究了鹌鹑肠道D-葡萄糖转运，黏膜侧加入D-葡萄糖，之后加入根皮苷，试验记录Isc，发现，D-葡萄糖增加Isc；根皮苷降低Isc，抑制D-葡萄糖转运。
氨基酸（Amino acid）是构成蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子结构形态，使他的分子具有生化活性。蛋白质是生物体内重要的活性分子，包括催化新陈代谢的酵素和酶。何流琴等在研究缺乏赖氨酸对大鼠血清氨基酸含量和肠道氨基酸通透性的影响，应用尤斯灌流技术测定肠道转运氨基酸变化及赖氨酸的转运能力，该结果为研究赖氨酸等内源性氨基酸的代谢机制提供了基础。王斌等在对猪小肠钠离子依赖性氨基酸转运的研究中，利用Ussing chamber技术研究哺乳仔猪空肠对六种氨基酸的钠离子依赖转运机制，探讨不同浓度氨基酸在空肠转运的差异和特点，发现氨基酸的转运是耗能的主动运输过程；哺乳仔猪空肠对谷氨酸的转运能力很强，其次为苏氨酸、丝氨酸和甘氨酸，这些氨基酸的转运载体多为Na+依赖性的，而羟脯氨酸和精氨酸的转运主要不是通过离子性依赖系统进行。
矿物元素也称无机盐，是构成机体组织的重要物质。体内矿物元素存在形式多种多样，但主要是以蛋白质及氨基酸相结合的形式存在，也有以游离状态存在。张志博等应用尤斯灌流技术研究厚朴酚与和厚朴酚对肠道钙离子转运的影响及其抗腹泻机制，结果表明，厚朴酚与和厚朴酚均可不同程度影响IEC-6细胞内钙离子的转运，可通过细胞膜上的电压依赖性钙通道以及受体操控型钙通道来调节胞内钙库的释放和胞外钙的内流来影响细胞内钙离子浓度，并达到抗腹泻作用。贺志雄等应用尤斯灌流法测定断奶后羔羊胃肠道消化吸收能力，结果表明，动物体生命早期不同时期瘤胃、空肠和回肠有着不同的分泌、屏障及吸收特征； 1-2周（断奶过渡期）肠道结构和功能发生紊乱，可能导致动物产生腹泻。
瘤胃上皮不仅是瘤胃微生物附着生长并进行消化和代谢的主要部位也是营养物质吸收转运代谢的主要场所，同时瘤胃上皮组织较其他组织更适合进行物质吸收、转运以及代谢研究。利用尤斯灌流技术对瘤胃上皮组织的研究或许是今后研究的热点，同时也可以为瘤胃上皮对营养物质的吸收与转运机制提供更为准确的理论依据。
优点与缺点分析
优点：尤斯灌流技术提供一个短期的离体组织培养的方法，较之传统的体外培养方法具有快捷，简便等特点，通过对转运电流等一些列的电参数的测定，用以说明是否有载体或外流泵参与转运；能对转运的不同阶段进行研究。尤斯灌流系统的研究对象为上皮组织，而上皮组织广泛分布在身体表面和体内各种囊、管、腔的内表面。上皮组织具有保护、分泌、吸收和排泄等功能，不同部位的不同上皮其功能各有差异。如分布在身体表面的上皮以保护功能为主；体内各管腔面的上皮，除具有保护功能外尚有分泌和吸收等功能；某些上皮组织，从表面生长到深部结缔组织中去，分化成为具有分泌功能的腺上皮。因此，尤斯灌流的研究对象可扩展到机体任意上皮组织。就某一具体上皮组织而言，可研究的内容也更加多样。
缺点：研究对象单一，尤斯灌流系统研究对象为上皮组织，很少涉及细胞学研究，特别是对细胞内药物吸收与转运机制的研究。用一个相对少量的测量来解释复杂的肠粘膜上皮组织的生理系统，无法考虑细胞间和旁分泌所带来的影响。胃肠道上皮离体后组织形态学和生理活性都会在一定时间之后迅速改变或下降，有研究表明Soderholm，肠道上皮离体90-120min后大部分标本都出现了组织形态学的改变，生理活性无明显异常。离体240min后ATP降低至正常值的30%，组织的通透性明显提高，这与实际应用有所矛盾。灌流室片组织样品固定夹与都是固体，难以保证其密封性，在利用尤斯灌流室研究物质转运过程中发现有漏液的情况出现，溶液是从安插组织样品固定夹片的位置渗漏，对实验结果的准确性造成严重的影响。
尤斯灌流技术是一种首先用于研究离子通道而逐步发展起来的技术，以其快捷、简便等特点，并它能比较真实地反映各种上皮细胞在体内的实时状态，受到广大医药学领域工作者的青睐。随着这一技术的不断完善，尤斯灌流技术必将为畜禽胃肠道屏障功能和营养物质转运过程与机制研究作出重要贡献。
参考文献（略）
（湖南农业大学动物科学技术学院湖南·长沙410128）
摘要：尤斯灌流技术被誉为肠道屏障功能研究的金标准，关于尤斯灌流系统在肠道屏障功能研究已成为热点，但有关尤斯灌流技术在营养物质转运方面的研究还很匮乏，本文对尤斯灌流室的基本原理和构造作简要综述，并综合国内外学者的研究进展，总结了尤斯灌流技术在肠道营养物质转运研究中的应用。
关键词：尤斯灌流；肠上皮组织；营养物质；转运
1951年，丹麦学者Hans Ussing在对上皮组织离子转运的研究中，首次将Ussing chamber（尤斯室，Ussing灌流室）介绍于世，其主要功能是利用微电极检测整个细胞膜离子通道变化的电流信号，来反映肠道药物吸收、通透性和分泌情况的变化。近些年来，关于尤斯灌流系统在肠道粘膜屏障功能研究已成为热点，但尤斯灌流系统在肠道营养物质转运中的研究或许可以为养殖生产带来更实际的帮助。
尤斯灌流系统的基本构造
尤斯灌流系统主要由灌流室、电路系统、数据采集系统、恒温装置以及配套系统组成。常见的灌流室有2、4、6和8室4种类型。根据工艺不同可将其分为持续式和循环式灌流室。持续式灌流室包括2个溶液贮器，通过聚乙烯管道将溶液引入2个半室，并设阀门控制流速。循环式灌流室由1个U形管道和2个半室组成，2个半室中间是1个用于嵌合组织样本且可移动的滑块，它可以有效降低灌流过程中上皮组织所受到的损伤。
上皮组织由密集排列的上皮细胞和少量细胞间质组成，具有极性和紧密连接，这也是区别于其他组织的两大特征。极性是因为细胞游离面（或顶面）和基底面结构和功能的分布不均造成的；而紧密连接又称闭锁小带，常见于单层柱状上皮和单层立方上皮中，位于相邻细胞间隙的顶端侧面，紧密连接除具机械连接作用外，更重要的是封闭细胞间隙，阻止细胞外的大分子物质经细胞间隙进入组织内。紧密连接的形状和渗透性决定上皮组织的完整性以及对物质的阻抗力。
尤斯灌流系统在肠道营养物质转运中的研究
经食道而来的物质在胃和小肠内被降解为葡萄糖、小肽、游离脂肪酸和氨基酸等物质，通过胃肠道上皮细胞基顶膜转运载体进入胃肠壁内，再通过基底膜转运载体转出，进入血液循环供肠道和其他组织利用。提高畜禽胃肠道上皮细胞的分泌作用对营养物质的吸收转运效率对于减少饲养成本，促进动物生长具有重要意义。应用尤斯灌流技术研究营养物质在肠道中的转运主要集中在葡萄糖、氨基酸以及矿物质的转运方面。
葡萄糖是自然界分布最广且最为重要的一种单糖，是生物体内新陈代谢不可缺少的营养物质，其主要消化部位在小肠。因此，研究肠道上皮对葡萄糖的转运效率至关重要。葡萄糖经肠道上皮细胞顶膜Na+-葡萄糖-载体蛋白主动转运进入细胞，并由基底膜葡萄糖转运载体转运进入血液。葡萄糖转运过程中Na+跨膜转运产生的离子电流，为Ussing chamber技术在葡萄糖转运研究中的应用创造了条件，并以Isc的变化反映葡萄糖的转运规律。Millar等利用Ussing chamber研究表皮生长因子（EGF）对兔空肠葡萄糖转运的影响，其结果表明EGF通过PKC和PI3-激酶途径促进3-O-甲基葡萄糖的转运。Gar-cia-Amado等利用Ussing chamber技术研究了鹌鹑肠道D-葡萄糖转运，黏膜侧加入D-葡萄糖，之后加入根皮苷，试验记录Isc，发现，D-葡萄糖增加Isc；根皮苷降低Isc，抑制D-葡萄糖转运。
氨基酸（Amino acid）是构成蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子结构形态，使他的分子具有生化活性。蛋白质是生物体内重要的活性分子，包括催化新陈代谢的酵素和酶。何流琴等在研究缺乏赖氨酸对大鼠血清氨基酸含量和肠道氨基酸通透性的影响，应用尤斯灌流技术测定肠道转运氨基酸变化及赖氨酸的转运能力，该结果为研究赖氨酸等内源性氨基酸的代谢机制提供了基础。王斌等在对猪小肠钠离子依赖性氨基酸转运的研究中，利用Ussing chamber技术研究哺乳仔猪空肠对六种氨基酸的钠离子依赖转运机制，探讨不同浓度氨基酸在空肠转运的差异和特点，发现氨基酸的转运是耗能的主动运输过程；哺乳仔猪空肠对谷氨酸的转运能力很强，其次为苏氨酸、丝氨酸和甘氨酸，这些氨基酸的转运载体多为Na+依赖性的，而羟脯氨酸和精氨酸的转运主要不是通过离子性依赖系统进行。
矿物元素也称无机盐，是构成机体组织的重要物质。体内矿物元素存在形式多种多样，但主要是以蛋白质及氨基酸相结合的形式存在，也有以游离状态存在。张志博等应用尤斯灌流技术研究厚朴酚与和厚朴酚对肠道钙离子转运的影响及其抗腹泻机制，结果表明，厚朴酚与和厚朴酚均可不同程度影响IEC-6细胞内钙离子的转运，可通过细胞膜上的电压依赖性钙通道以及受体操控型钙通道来调节胞内钙库的释放和胞外钙的内流来影响细胞内钙离子浓度，并达到抗腹泻作用。贺志雄等应用尤斯灌流法测定断奶后羔羊胃肠道消化吸收能力，结果表明，动物体生命早期不同时期瘤胃、空肠和回肠有着不同的分泌、屏障及吸收特征； 1-2周（断奶过渡期）肠道结构和功能发生紊乱，可能导致动物产生腹泻。
瘤胃上皮不仅是瘤胃微生物附着生长并进行消化和代谢的主要部位也是营养物质吸收转运代谢的主要场所，同时瘤胃上皮组织较其他组织更适合进行物质吸收、转运以及代谢研究。利用尤斯灌流技术对瘤胃上皮组织的研究或许是今后研究的热点，同时也可以为瘤胃上皮对营养物质的吸收与转运机制提供更为准确的理论依据。
优点与缺点分析
优点：尤斯灌流技术提供一个短期的离体组织培养的方法，较之传统的体外培养方法具有快捷，简便等特点，通过对转运电流等一些列的电参数的测定，用以说明是否有载体或外流泵参与转运；能对转运的不同阶段进行研究。尤斯灌流系统的研究对象为上皮组织，而上皮组织广泛分布在身体表面和体内各种囊、管、腔的内表面。上皮组织具有保护、分泌、吸收和排泄等功能，不同部位的不同上皮其功能各有差异。如分布在身体表面的上皮以保护功能为主；体内各管腔面的上皮，除具有保护功能外尚有分泌和吸收等功能；某些上皮组织，从表面生长到深部结缔组织中去，分化成为具有分泌功能的腺上皮。因此，尤斯灌流的研究对象可扩展到机体任意上皮组织。就某一具体上皮组织而言，可研究的内容也更加多样。
缺点：研究对象单一，尤斯灌流系统研究对象为上皮组织，很少涉及细胞学研究，特别是对细胞内药物吸收与转运机制的研究。用一个相对少量的测量来解释复杂的肠粘膜上皮组织的生理系统，无法考虑细胞间和旁分泌所带来的影响。胃肠道上皮离体后组织形态学和生理活性都会在一定时间之后迅速改变或下降，有研究表明Soderholm，肠道上皮离体90-120min后大部分标本都出现了组织形态学的改变，生理活性无明显异常。离体240min后ATP降低至正常值的30%，组织的通透性明显提高，这与实际应用有所矛盾。灌流室片组织样品固定夹与都是固体，难以保证其密封性，在利用尤斯灌流室研究物质转运过程中发现有漏液的情况出现，溶液是从安插组织样品固定夹片的位置渗漏，对实验结果的准确性造成严重的影响。
尤斯灌流技术是一种首先用于研究离子通道而逐步发展起来的技术，以其快捷、简便等特点，并它能比较真实地反映各种上皮细胞在体内的实时状态，受到广大医药学领域工作者的青睐。随着这一技术的不断完善，尤斯灌流技术必将为畜禽胃肠道屏障功能和营养物质转运过程与机制研究作出重要贡献。
参考文献（略）
