基于石墨烯和金纳米粒子的铜离子配位-分子印迹电化学传感器用于凝血酶的检测

2022.07.18

柏朝朋　杨绍明　滕渝　张剑

摘要利用分子印迹技术与铜离子（Cu2+）配位单元为双重识别模式，使用层层自组装先将L-半胱氨酸（L-cys）通过AuS键组装到石墨烯（rGO）和金纳米粒子（AuNPs）修饰的玻碳电极表面，再将Cu-凝血酶（THR）络合物通过L-cys与Cu2+配位作用组装到电极表面，以硫堇（Tn）为聚合单体，使用电聚合法聚合得到分子印迹膜，制备了具有双重识别模式的金属离子配体-分子印迹电化学传感器。采用扫描电镜（SEM）和能谱色散仪（EDS）对复合纳米材料进行表征。利用循环伏安法（CV）、交流阻抗法（EIS）和差分脉冲伏安法（DPV）对传感器性能进行了研究，在最佳检测条件下，传感器响应与THR浓度在2.0×10-9～5.0×10-7 g/L范围内呈良好的线性关系，线性方程为-ΔI （μA）= 17.73 + 1.84 lgc（g/L）。构建了THR 分子印迹电化学传感器的动力学吸附模型，测得印迹传感器的印迹因子β=4.32，结合速率常数k=5.68 s。传感器表现出良好的稳定性和重现性，可用于实际样品中凝血酶的检测。

关键词石墨烯; 金纳米粒子; 凝血酶; 双重识别模式; 分子印迹电化学传感器

1 引言

分子印迹电化学传感器（MIECSs）是基于分子印迹技术（MIT）和电化学检测技术，利用分子印迹聚合物（MIPs）作为特异性识别元件，对模板分子具有高选择识别性能的一类传感器。MIECSs兼具分子印迹技术和电化学传感器的优势，具有灵敏度高、稳定性好、实用性强、制备和检测成本低等优点[1]，在环境检测[2]、食品检测[3]、药品检测[4]和化妆品检测[5]等领域应用广泛。随着分子印迹技术的不断发展，分子印迹电化学传感器的检测范围也不断扩大，分析物质从双酚A[6]、多巴胺[7]、槲皮素[8]等小分子物質发展到蛋白质[9]、DNA[10]等生物大分子。近年来，对蛋白质大分子的分子印迹传感器研究逐渐深入，已成功制备了牛血清白蛋白[11]，血红蛋白[12]，溶菌酶[13]，细胞色素[14]，葡萄糖氧化酶[15]等多种蛋白质的印迹传感器，拓宽了分子印迹电化学传感器的实际应用范围。但是，目前分子印迹传感器检测蛋白质分子还面临着诸多挑战，如蛋白质体积大、功能基团空间结构复杂、对温度和pH值敏感、识别单一、特异性较差等。因此，开发一种协同识别、特异性好、快速、高灵敏的蛋白质分子印迹电化学传感器具有十分重要的意义。本研究构建了一种双重识别模式的金属离子配位-分子印迹电化学传感器，对蛋白质分子进行特异性识别，这种双重识别来源于金属离子配位和表面分子印迹的共同作用。金属Au纳米粒子（AuNPs）与模板分子中的L-半胱氨酸（L-cys）的巯基形成AuS金属键，含氮化合物作为金属离子配体，L-cys分子中的氨基氮和羰基氧中孤对电子与Cu2+形成稳定的配合物; 印迹分子洗脱后的聚合物骨架上留有与印迹分子在空间结构和化学官能团两方面均互补的识别部位。在共价键和多个识别位点作用力的协同作用下，实现对蛋白质分子多方位多角度的识别。

在分子印迹电化学传感器检测蛋白质的研究中，常规蛋白质印迹传感器存在检测分析信号响应较差＼，灵敏度不足等缺点，为解决该问题，研究者将碳纳米材料[16，17]、金属纳米颗粒[17，18]、量子点[19，20]等应用到传感器表面，作为增敏材料，提高电子传输速率和导电性，增强灵敏度。相比于其它增敏材料，石墨烯（rGO）具有二维平面结构、大的比表面积和优良的电子传导速率，常作为基质用于制备各类传感器[21～23]; 金纳米粒子（AuNPs）具有优异的导电和催化性能[23，24]，故两种增敏材料在分子印迹电化学传感器领域备受关注。如Jin等[22]使用电沉积和电聚合法在泡沫镍（NF）上制备了MIPs/rGO-AgNPs/NF传感器，对实际样品中的天麻素进行灵敏和选择性检测。Yun等[23]制备了以AuNPs和rGO为敏化材料的分子印迹传感器，用于金刚烷胺的灵敏检测，结果表明，该传感器具有较宽的检测范围、较低的检出限和高的选择性。李颖等[24]基于磁性氧化石墨烯包裹的金纳米粒子（[email protected]）复合材料制备了分子印迹传感器，并对邻苯二甲酸二丁酯进行检测，结果表明，该传感器具有很高的选择性和灵敏度。

本研究将rGO和AuNPs增敏纳米材料修饰到玻碳电极表面，然后通过AuS键将L-cys结合到修饰电极上，再利用L-cys分子中的氨基氮和羰基氧官能团与Cu2+配位作用将Cu-THR络合物固定到电极表面，最后通过在硫堇（Tn）溶液内电聚合形成印迹THR分子的聚硫堇（PTn）膜，制备得到双重识别的铜离子配体-分子印迹电化学传感器。此传感器克服了单独分子印迹空穴对目标物的单一识别灵敏度低、选择性不佳等缺点。利用循环伏安法（CV）、交流阻抗法（EIS）和差分脉冲伏安法（DPV）对传感器性能进行研究，并将其应用于实际血样中凝血酶的检测。

2 实验部分

2.1 仪器和试剂

CHI 660C电化学工作站（上海辰华仪器公司）; JSM-6701F场发射型扫描电镜（日本电子JEOL公司）; 三电极体系（直径3 mm玻碳电极为工作电极，铂柱电极为对电极，Ag/AgCl为参比电极）。

氯金酸（HAuCl4，分析纯，Sigma公司）; 无水CuSO4（>99%，汕头西陇化工有限公司）; 石墨（光谱纯，汕头西陇化工公司）; 硫堇（>99%，上海化学试剂公司）; 抗坏血酸（>99%，上海试剂厂）; 盐酸多巴胺（分子生物学级，阿拉丁试剂）; 柠檬酸三钠（AR，汕头西陇化工有限公司）; 凝血酶（≥200 U/mg，博美生物公司）; L-半胱氨酸（>98.5%，上海蓝季科技有限公司）; 牛血清白蛋白（BSA，上海晶纯有限公司）。

2.2 氧化石墨烯（GO）的制备

采用文献[25＼]的方法制备氧化石墨并稍作改进。在冰水浴条件下，将2.0 g石墨粉加入25 mL浓H2SO4，置于三颈瓶中，进行搅拌。缓慢加入6 g P2O5和5 g过硫酸钾，在80℃水浴条件下，搅拌反应5 h。另取一个烧杯，在其中加入250～300 mL蒸馏水，将上述反应液转入其中，水洗2～3次，干燥后，得到预氧化的石墨。

取1.0 g预氧化的石墨粉末，在冰浴条件下加入50 mL 浓H2SO4、3. 0 g KMnO4和1.2 g KNO3，然后水浴缓慢升温至约35℃，搅拌反应2 h 后，在冰浴条件下，缓慢加入100 mL 蒸馏水，搅拌10 min， 35℃水浴条件下搅拌反应2 h。将混合液转入烧杯中，加入30% H2O2处理，溶液颜色由棕褐色变成亮黄色。静置一段时间后，倒去上层清液，用10% HCl清洗3 次，离心过滤，用蒸馏水反復洗涤至中性，45℃ 真空干燥48 h，得到GO样品，干燥保存，备用。

2.3 修饰电极的制备

GCE按照文献[26＼]方法进行预处理。用粒径0.05 μm的氧化铝（Al2O3）抛光粉在麂皮上抛光打磨，依次于丙酮、无水乙醇和去离子水中超声清洗5 min，然后于5 mmol/L K3Fe（CN）6（含0.1 mol/L KCl）中进行循环伏安扫描，用去离子水冲洗干净，在0.5 mol/L H2SO4中于1.5～-0.4 V下进行循环伏安扫描，直到得到稳定的可重复的循环伏安曲线。用去离子水冲洗干净，再用高纯N2吹干，待用。

将预处理后的GCE置于1 g/L GO溶液中，在-1.7～+0.2 V范围内，以25 mV/s的扫速循环伏安扫描20圈，得到还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极（rGO/GCE）。取2 mL 2 mmol/L HAuCl4加入6 mL 磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH=6.0），在N2中除氧10 min。将rGO/GCE置于PBS中，以50 mV/s的扫速，在电位范围+0.1～-0.9 V条件下扫描15圈，得到AuNPs/rGO/GCE修饰电极; 然后放入0.05 mol/L H2SO4溶液内循环伏安扫描至曲线稳定，以去除多余吸附杂质。N2吹干后，置于10 mmol/L L-cys溶液中浸泡24 h，冲洗干净，得到 L-cys/AuNPs/rGO/GCE修饰电极。

Cu-THR混合液的配制：将THR用缓冲溶液配制成0.2 g/L的储备液，取80 μL 0.2 g/L THR储备液与15 μL 0.05 mol/L CuSO4溶液和5 μL 0.1 mol/L NaOH溶液混合，在20℃条件下孵育。将L-cys/AuNPs/rGO/GCE电极置于上述配好的Cu-THR混合液中孵育结合10 h，取出冲洗并晾干。将修饰电极置于含1 mmol/L Tn的PBS溶液（pH=6.0）内，在+1.5 V阳极化450 s后，然后在0.1～0.4 V范围内聚合40圈，转入20 mmol/L EDTA溶液中洗脱15 min，再置于0.05 mol/L NaOH溶液中洗脱20 min，制得MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE传感器。非印迹传感器（NIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE）的制备过程与MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE相同，只是在所有溶液中均不加入THR。

2.4 电化学测试方法

电化学测试均在CHI660C电化学工作站上进行，实验过程均在室温（25℃）下进行。在含0.1 mol/L KCl的5 mmol/L K3[Fe（CN）6＼]/K4[Fe（CN）6＼]溶液中测量交流阻抗图谱，频率范围为1～100000 Hz，振幅为0.005 V。

2.5 样品前处理

以稀释50%的血液样品为储备液。取100 mL储备液加入0.4 g柠檬酸三钠，混合均匀， 3000 r/min离心15 min，所得上清液为血浆。取10 μL稀释1000倍后的血浆进行实际样品检测。

3 结果与讨论

3.1 AuNPs/rGO/GCE的形貌表征和能谱分析

图1为AuNPs/rGO/GCE的扫描电镜图（SEM）和能谱图（EDS）。由图1A可见，60～80 nm大小的形状规则的球形AuNPs颗粒均匀分布在电极表面，这种结构能显著增大电极的比表面积。图1B为修饰电极表面的能谱分析，可见出现了C、O、Au元素的峰，证明已成功制备AuNPs/rGO/GCE修饰电极。

3.2 修饰电极的制备

在0.5 mol/L K3Fe（CN）6溶液中，不同修饰电极的CV图见图2A。AuNPs/rGO/GCE（曲线a）在L-cys溶液中浸泡一定时间后，CV峰电流明显增大，如曲线b所示，这是因为L-cys拥有优良的电化学活性，能够促进探针[Fe（CN）6＼]3-4在电极表面传递，因此峰电流增大，也表明L-cys/AuNPs/rGO/GCE制备成功。将L-cys/AuNPs/rGO/GCE电极放入到Cu-THR溶液中孵育一段时间后，再次在K3Fe（CN）6溶液中进行CV扫描，峰电流明显减小（曲线c），说明Cu-THR配合物结合到了电极上，阻碍探针[Fe（CN）6＼]3-4在电极上的反应。

采用CV法在对MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE洗脱前后、孵育后的电流信号变化进行表征，如图2B所示。CV图是在PBS（pH=6.0，0.1 mol/L NaCl）溶液中以100 mV/s的扫速，在0.2～-0.6 V范围内扫描得到。由曲线a可知，MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE在约-0.2 V出现了一对氧化还原峰; 在EDTA和NaOH溶液中洗脱后，此对氧化还原峰的峰电流信号明显增大（曲线b），印迹膜中嵌入的模板分子被洗脱，留下了特异性的识别孔穴，使得PTn与基底GCE更容易发生电子交换; 去除模板后的MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE传感器浸泡在0.05 mol/L CuSO4溶液，再浸入THR溶液孵育后，氧化还原峰电流减小（曲线c），说明一部分特异性识别孔穴又与THR结合而被占据，阻碍了PTn在电极上的反应。图2B的内插图为NIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE的对照CV图。虽然d、e、f都在-0.2 V有一对氧化还原峰，但是洗脱前后孵育后曲线的峰电流大小变化并不大，说明聚合膜上没有孔穴使得PTn与基底电极之间的电子交换增强。

图2 （A）不同修饰电极的CV图：（a） AuNPs/rGO/GCE; （b） L-cys/AuNPs/rGO/GCE; （c） Cu-THR/L-cys/AuNPs/rGO/GCE; （B）MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE的CV图：（a）洗脱前; （b）洗脱后; （c）孵育后。内插图为NIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE的CV图：（d）模板洗脱前; （e）模板洗脱后; （f）在CuSO4溶液（0.05 mol/L）和THR溶液（8.0×10-8 g/L）孵育后; （C）修饰电极的EIS图：（a）裸GCE; （b） rGO/GCE; （c） AuNPs/rGO/GCE; （d） L-cys /AuNPs/rGO/GCE; （e） Cu-THR/L-cys/AuNPs/rGO/GCE; （D）MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE的EIS圖：（f）模板洗脱前; （g）模板洗脱后; （h）模板再孵育后

Fig.2 （A） Cyclic voltammetry （CV） diagrams of modified electrodes：（a） AuNPs/rGO/GCE; （b） L-cys/AuNPs/rGO/GCE; （c） Cu-THR/L-cys/AuNPs/rGO/GCE. （B） CV diagrams of MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE：（a） before template extracting; （b） after template extracting; （c） after rebinding CuSO4 （0.05 mol/L） and THR （8.0×10-8 g/L）. Inset is the CV curve of NIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE：（d） before template extracting; （e） after template extracting; （f） after rebinding CuSO4 （0.05 mol/L） and THR （8.0×10-8 g/L）. （C） EIS response of modified electrodes：（a） bare GCE; （b） rGO/GCE; （c） AuNPs/rGO/GCE; （d） L-cys/AuNPs/rGO/GCE; （e） Cu-THR/L-cys/AuNPs/rGO/GCE. （D） EIS response of MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE：（f） before template extracting; （g） after template extracting; （h） after rebinding CuSO4 （0.05 mol/L） and THR （8.0×10-8 g/L）. THR， thrombin; MIPs， molecular imprinted polymers; Cys， cysteine

电化学阻抗谱（EIS）是描述电极表面和界面电阻情况非常有效的手段。Nyquist阻抗图谱中由一个半圆和一条直线组成，高频区的半圆直径对应电子转移的阻值，即电子转移阻抗（Ret）。图2C和2D为不同阶段的修饰电极在5 mmol/L K3[Fe（CN）6＼]/K4[Fe（CN）6＼]（含 0.1 mol/L KCl）溶液中的EIS图。裸玻碳电极（曲线a）的阻抗较小（Ret=95 Ω）; 曲线b对应rGO/GCE电极（Ret=67 Ω）; 曲线c为AuNPs/rGO/GCE电极（Ret=51 Ω），其阻抗值比曲线a 和b的阻抗值都小，说明rGO和AuNPs的修饰提高了电子在电极表面的传递速度; 曲线d为L-cys/AuNPs/rGO的电极（Ret=57Ω），阻抗值变化不大，因为L-cys本身具有电活性，修饰到电极上并不会阻碍电子的传递; 曲线e为Cu-THR/L-cys/AuNPs/rGO/GCE电极（Ret=514 Ω），电极在Cu-THR溶液中孵育后，THR结合到电极上，阻碍电子的传递，阻抗变大。曲线f、g、h表示了MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE 传感器在洗脱前后及孵育后的电极的阻抗。曲线f较曲线e的阻抗变小，Ret= 203 Ω，说明Cu-THR/L-cys/AuNPs/rGO/GCE在Tn溶液中聚合后，生成的PTn膜具有电导性，促进[Fe（CN）6＼]3-4-在电极上的传递; 而洗脱后的曲线g阻抗又进一步变小，说明去除电极上的模板分子，留下了一部分特异性的识别孔穴，有利于电子在电极表明的传递; 在THR溶液中孵育后的修饰电极的阻抗变大，表明THR占据了一部分孔穴，阻碍了电子传递。

3.3 孵育时间的影响

将MIPs/AuNPs/rGO/GCE置于浓度为8.0×10-8 g/L THR溶液中孵育不同时间，用DPV法进行检测。结果表明，随着孵育时间延长，传感器的响应电流逐渐变小，20 min后基本稳定，说明电极上的特异性孔穴对THR达到吸附平衡。选择20 min为传感器的吸附时间。

3.4 MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE传感器对THR的检测

图3为分子印迹修饰电极在不同浓度的THR孵育后在PBS溶液中的DPV曲线。由图3A可知，随着THR浓度增大，修饰电极在PBS溶液中的DPV检测的峰电流逐渐变小，这表明更多的THR通过与Cu2+形成配合物结合到印迹膜上，占据印迹膜上的孔穴，阻隔了PTn与基底电极之间的电子交换。如图3B所示，在2.0×10-9～5.0×10-7 g/L（0.055 pmol/L～14 pmol/L）范围内，传感器电流变化与THR浓度对数呈良好的线性关系，线性方程为ΔI（μA）=17.73+1.84 lgc （g/L），线性相关系数为R=0.996，检出限（S/N=3）为0.78 ng/L（21 fmol/L）。

将制备的双识别模式的铜离子配位-分子印迹电化学传感器与文献报道的检测凝血酶传感器的性能进行比较（表1）。结果表明，本研究构建的双识别模式的铜离子配位-分子印迹电化学传感器的线性范围较大、检出限较低，这是由于其将具有大的比表面积和良好导电性的石墨烯和金纳米粒子作为基底，分子印迹空穴能特异性识别THR，而且Cu2+配位能加强THR与电极表面的键合力，有效提高了传感器的性能。

3.5 MIPs/L-cys/AuPs/rGO/GCE传感器的抗干扰能力

图4A为PBS缓冲溶液（含0.2 mol/L NaCl pH=6.0）配制的浓度为7.8×10-9 mol/L的THR溶液和10倍浓度（7.8×10―8 mol/L）的牛血清白蛋白（BSA）、盐酸多巴胺（DPA）、抗坏血酸（AA）的DPV测试结果。由图4可见，MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE传感器对10倍THR浓度的干扰物的响应电流非常小，说明MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE的特异性识别孔穴只与目标分子发生特异性结合，具有良好的选择性。由于NIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE没有特异性识别位点，无法与目标测试分子进行特异性结合，所以NIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE对目标分子和干扰物质的电流响应都很小。

3.6 配位印迹膜电极传感器对THR识别过程动力学模型

图4B为MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE、NIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE在7.8×[email protected]@9 mg/mL THR溶液中的吸附图，根据Langmuir吸附模型，拟合各种电极吸附THR的动力学曲线：

根据印迹因子公式计算出THR分子印迹电化学传感器的印迹因子β=4.32。 β数值越大，表明传感器对目标分子的印迹能力越好。MIPs电极结合模板分子的速率远远大于NIPs的速率，因为Cu2+的配位键作用使得MIPs结合能力更强、选择性更好，而NIPs电极表面没有结合位点，THR无法与印迹膜结合。

3.7 MIPs/L-cys/AuPs/rGO/GCE传感器的重现性和稳定性

在最佳检测条件下，采用同一根电极对7.8×10-9 mol/L THR溶液平行测定3次，电极响应的相对标准偏差（RSD）为4.6%; 在相同条件下制备3根电极，对7.8×10-9 mol/L THR溶液进行测定，电极响应的RSD为5.3%，表明本研究制备的MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE传感器具有良好的重现性。将制备好的MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE传感器于4℃条件下保存1周后，响应电流为初始响应电流的90.3%，表明此传感器具有良好的稳定性。

3.8 血液样品分析

为了验证制備的分子印迹MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE传感器在实际样品检测中的效果，对实际血样进行了检测，加标回收实验结果如表3所示。本传感器测定凝血酶回收率较高，具有良好的实用性，可用于凝血酶样品的测定。

4 结论

采用铜离子配位和分子印迹构建双识别模式制备MIPs/L-cys/AuNPs/rGO/GCE传感器，利用循环伏安法、交流阻抗法和差分脉冲伏安法对传感器性能进行研究，在最佳检测条件下，传感器对凝血酶在2.0×10-5.0×10-7 g/L浓度范围内呈良好的线性关系，结果表明，具有双识别模式的新型分子印迹电化学传感器对凝血酶有良好的信号响应。此传感器具有制备简单、检出限低、灵敏度高、抗干扰性强、良好的实用性等优势，有望用于实际样品中凝血酶的检测。

References

1 Yola M L， Atar N， Eren T， Karimi-Maleh H， Wang S. RSC Adv.， 2015， 5（89）： 72590-72591

2 Yao T， Gu X， Li T， Li J， Zhao Z， She Y. Biosens. Bioelectron.， 2016， 75： 96-100

3 Ding H， Jiao H F， Shi X Z， Sun A L， Guo X Q， Li D X， Chen J. Sens. Actuators B， 2017， 246： 510-517

4 Zhao H， Wang H， Quan X， Tan F. Procedia Environ. Sci.， 2013， 18： 249-257

5 Liu M， Li X， Li J， Wu Z， Wang F， Liu L， Lei F. J. Colloid Interface Sci.， 2017， 504： 124-133

6 Guo W， Hu W， Pan J， Zhou H， Guan W， Wang X， Xu L. Biochem. Eng. J.， 2011， 171（2）： 603-611

7 Mao Y， Bao Y， Gan S， Li F， Niu L. Biosens. Bioelectron.， 2011， 28（1）： 291-297

8 Cheng Y， Nie J， Li J， Liu H， Yan Z， Kuang L. Food Chem.， 2019， 287： 100-106

9 Liu Y， Wang Y， Dai Q， Zhou Y. Anal. Chim. Acta， 2016， 936： 168-178