重组猪α干扰素的聚乙二醇修饰研究

    李增++赵俊++王明丽

    摘要：采用分子量为20 kD单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯（mPEG-SC）修饰重组猪α干扰素，初步研究了修饰反应条件及分离纯化工艺。结果表明，单修饰PEG-IFNα的转化率达到65%，单修饰产品纯度达到97%。由于修饰产物相对分子质量和不均一性的增加，导致其体外杭病毒活性降低，抗病毒活性保留达到未修饰重组猪α干扰素的29%，仍然具有良好的抗病毒作用。

    关键词：聚乙二醇；重组猪α干扰素；修饰

    中图分类号：S828 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2015）06-0005-02

    PEG（聚乙二醇）是一种中性、水溶性、无毒性的聚合物。在水溶液中长链的PEG分子，具有高水合性，可以附着到其他分子和表面上，提供了一个生物相溶的、保护性外壳。这种保护性外壳降低了生物系统对这些材料的清除能力，极大的降低了蛋白质、细胞和细菌的吸附，降低了肾脏的清除率。PEG在水和许多有机溶剂中可溶，在水溶液中它和其他聚合物如葡聚糖一起可形成双相系统。双功能PEG的水溶性、无毒性、高柔性和特征明确的化学特性，使它成为理想的修饰蛋白类产品的交联材料[1]。PEG与干扰素的偶联已广泛应用于用于临床。如先灵葆雅公司开发的聚乙二醇化人干扰素α-2β（商品名，佩乐能，PegIntron）；罗氏公司开发的聚乙二醇化人干扰素α-2β（商品名，派罗先，PegasyS）等。已经证实被偶联后的干扰素，生物学活性大部分得以保留，同时免疫应答极大地降低，血清半衰期也极大地得到了延长。

    动物α型干扰素对畜禽病毒性疾病具有较好的防治效果。安徽医科大学微生物学教研室采用基因工程技术克隆并表达了猪α型干扰素，并将实验室合格产品制成冻干粉针剂发送至安徽省多家养猪场进行临床试验。结果证明，该室研制的重组猪α干扰素能有效治疗猪病毒性疾病。对治疗猪病毒性腹泻有效率为83.5%，治愈率为63.9%。在该项目的基础上，对重组猪α干扰素进行聚乙二醇化修饰，以获得长效制剂，从而延长药物在体内循环半衰期、减少体内清除率，减少给药次数、降低动物的应激性、增强疗效、降低用药成本。作为新型兽药的开发这一项目有重要的学术价值和应用前景，同时具有较高的社会效益和经济效益。

    本研究采用分子量大、反应条件温和的20 kΔ单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯（μ∏EΓ-∑X）修饰剂对重组猪α干扰素进行了修饰（图1），并通过控制反应条件，期望获得半衰期更长、更稳定，且体外活性保留较高的∏EΓ化重组猪α干扰素产物。且对该单修饰产物进行了纯度、体外抗病毒活性进行了检测，为进一步考察其药代动力学和药效学性质奠定了基础。

    1 材料与方法

    1.1 试验材料

    原料：单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯（mPEG-SC），重组猪α干扰素。

    仪器：Amersham Pharmacia公司的AKT A Explorer 色谱系统；北京六一仪器厂的DYY-Ⅲ -4稳压稳流电泳仪。

    试剂：牛血清白蛋白；甲叉丙烯酰胺； 丙烯酰胺、SDS；考马斯亮蓝R250； RRMI 1640培养基；小牛血清； 其余试剂均为国产分析纯或生化纯试剂。

    1.2 试验方法

    1.2.1 聚乙二醇-重组猪α干扰素的制备与纯化 干扰素用5 mmol/L pH3.0～5.0的磷酸二氢钾缓冲液稀释到0.1 mg/mL；加入计算量的干扰素，用NaOH溶液调节pH到8.0，按干扰素：mPEG为1∶20的物质的量加入1/4量的mPEG-SC，在0～4 ℃条件下反应，随后每间隔2 h加入1/4量的mPEG-SC，加入完毕后继续反应4 h，加入0.75 mol/L的甘氨酸1 mL终止反应；随后将上述反应液用5倍量体积、浓度为50 mmol/L pH 7.2的醋酸钠缓冲液稀释，然后上Superdex 75 Highload制备型凝胶色谱柱（26 mm×600 mm， 22～24μm），以5倍体积pH 7.2的醋酸钠缓冲液洗柱后，用含0.5 mol/L NaCl的醋酸钠缓冲液洗脱，收集含PEG-干扰素的洗脱液，浓缩，SDS-PAGE电泳检测。用Superdex 200对“（1）”中得到PEG化干扰素进一步纯化，洗脱液为pH 7.2的醋酸钠缓冲液（含0.2 mol/L NaCl），用波长为280 nm的紫外吸收检测，收集含PEG-干扰素的洗脱液，浓缩。

    1.2.2 SDS-PAGE电泳法对产物的检测 对浓缩的各洗脱峰采用SDS-PAGE电泳检测，分离胶10%，浓缩胶5%。电泳结束后，将胶体固定（固定液：30%甲醇、5%乙酸）室温摇动染色1 h（染色液：0.05%考马斯亮蓝、30%甲醇、5%乙酸）；最后将胶体移入脱色液（脱色液：1%戊二醛、30%甲醇、5%乙酸）中室温摇动浸泡直至条带清晰为止。

    1.2.3 蛋白浓度的测定 以牛血清蛋白为标准，按Lowry法[3]测定浓缩后的蛋白浓度。

    1.2.4 抗病毒活性的测定 采用WISH-VSV系统检测干扰素的抗病毒活性[4]。

    2 结果与分析

    2.1 聚乙二醇-重组猪α干扰素的制备与纯化

    猪α干扰素的等电点在6.2左右，经聚乙二醇修饰后，等电点有所降低，因此可采用离子交换层析的方法对反应产物进行分离纯化。结果如图2所示，经SDS-PAGE电泳检测结果表明，修饰后产物分离组分（聚乙二醇-重组猪α干扰素）呈单一条带，纯度能够达到97%。对条带3反应原液各组分经光密度计算可知反应修饰率能够达到65%。

    2.2 聚乙二醇-重组猪α干扰素抗病毒活性

    对WISH细胞用不同剂量的修饰干扰素进行处理，24 h后吸弃，再分别接种100 TCID50的VSV病毒。结果表明，聚乙二醇修饰后的重组猪α干扰素能够明显抑制VSV引起的细胞病变，通过效价测定（表1），所得的单修饰产物活性保留达到了29%。

    3 讨论

    蛋白质分子中的氧基有较高的亲核反应活性，而含有氨基的氨基酸主要有Lys和氮末端的氨基，对大部分蛋白来说，通常赖氨酸含量比较高，因而赖氨酸的氨基是最易被PEG修饰的位点[5]。酰基化PEG里包括经常使用的mPEG-SC、mPEG-SS。其中，自从90年代初开始开发mPEG-SC以来，由于其与蛋白反应时条件温和，应用的最多。

    本研究采用分子量为20 000 的单mPEG-SC对重组猪α干扰素进行了修饰。干扰素与干扰素修饰产物之间的主要差别之一是分子量的差异，因此本实验采用凝胶过滤色谱分离纯化聚乙二醇修饰重组猪α干扰素。这种分离模式是已经用于工业化生产，工艺成熟。利用该分离条件，我们成功的纯化获得聚乙二醇修饰重组猪α干扰素。此分离纯化模式相对比较稳定，回收率较为理想，一方面满足了后续聚乙二醇修饰重组猪α干扰素性质研究的需要，另一方面为它走向工业生产进行尝试，希望能为聚乙二醇修饰重组猪α干扰素产品的工业生产提供参考。抗病毒活性研究所得的修饰产品中IFN体外抗病毒活性随着修饰后相对分子质量的增加而降低，但活性保留达到了29%，仍然具有良好的抗病毒活性。

    在本研究中，实验的反应条件温和可控，对氮端修饰率高，分离纯化工艺简单，收率高，可获得高纯度高均一性的样品，确定了定点修饰干扰素的先导化合物，为后续开发研究工作奠定了基础。

    参考文献：

    [1] PASUT G，VERONESE F M.State of the art in PEGylation： The great versatility achieved after forty years of research [J]. J Control Release，2012，161（2）：461-472.

    [2] 赵 俊，张俊玲，李 增，等. 重组猪干扰素α1冻干粉针剂对猪的安全性试验研究[J].中国畜牧兽医，2014（1）： 195-198.

    [3] 闫 萍，杨 琦，王惠珍，等. 改良Lowry法和Bradford法测定蚯蚓提取物中蛋白质含量的比较[J]. 山西医科大学学报，2006 （1）：9-11.

    [4] 中华人民共和国卫生部.中国生物制品规程. 一部[M]. 北京：中国人口出版社，1995. 268-269.

    [5] 杨 旭，贡 济. 宇蛋白多肽类药物聚乙二醇化修饰研究进展[J]. 中国当代医药，2012，31（19）：16-20.