富血小板纤维蛋白对兔耳软骨移植成活情况的影响
高堂俊 赵宇 吴亮亮 贾大平 柳芳
[摘要]目的：研究自體富血小板纤维蛋白（Platelet-rich fibrin，PRF）对兔耳软骨移植后成活的影响，为临床应用提供证据。方法：选取16只新西兰大白兔，于兔双耳对称处设计并剥离出大小、形状相似，重量为80mg的耳软骨块，双侧耳软骨块随机分为对照组与实验组，对照组耳软骨块直接置入兔背部左侧浅筋膜腔隙内，实验组耳软骨块联合PRF共同置入兔背部右侧浅筋膜腔隙内。分别于2周、4周、8周、12周取材进行大体观察、重量比较及统计学分析、染色观察（HE染色、番红〇染色、阿利新蓝染色）。结果：通过大体观察和软骨重量可见：2～4周耳软骨块重量增加，8～12周耳软骨块重量减小，各时间点实验组耳软骨块重量均大于对照组，两组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。染色观察可见：各时间点在相同显微倍数、同一视野下实验组软骨细胞明显多于对照组，其中新生软骨细胞也多于对照组。实验组异染性软骨基质、蓝色的糖胺聚糖均更明显。结论：自体富血小板纤维蛋白能够促进兔耳软骨移植后的存活。
[关键词]富血小板纤维蛋白;鼻整形术;耳软骨移植;软骨吸收;软骨成活;细胞因子
[中图分类号]R622? ? [文献标志码]A? ? [文章编号]1008-6455（2020）12-0097-05
Effect of Platelet-rich Fibrin on the Survival of Rabbit Ear Cartilage Transplantation
GAO Tang-jun，ZHAO Yu，WU Liang-liang，JIA Da-ping，LIU Fang
（Department of Plastic Surgery，the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022，Anhui，China）
Abstract： Objective? To study the effect of autologous platelet-rich fibrin（PRF） on the survival of rabbit ear cartilage after transplantation， so as to provide evidence for clinical application. Methods? Sixteen New Zealand white rabbits were selected to design and strip out ear cartilage with similar size and shape and weight of 80mg on the symmetry of both ears. Both sides of ear cartilages were randomly divided into the control group and the experimental group. The piece of ear cartilage in control group was transplanted directly into the left side of the superficial fascia lacuna on the back of the rabbit ， the piece of ear cartilage in experimental group combine with PRF was transplanted into the right side of superficial fascia lacuna on the back of the rabbit. General observation， weight comparison and statistical analysis and staining which includ hematoxylin-eosin staining， saffron O staining and alcian blue staining were performed after 2 weeks， 4 weeks， 8 weeks and 12 weeks. Results? General observation and comparison of cartilage weight showed that： the weight of ear cartilage increased at 2-4 weeks， and decreased at 8-12 weeks. At each observation time， the weight of ear cartilage in the experimental group was greater than that in the control group. And the difference between the two groups was statistically significant （P<0.05）. Staining observation showed that：at each observation time， the chondrocytes in the experimental group were significantly more than those in the control group under the same microscopic scale and the same visual field. The heterochromatic cartilage matrix and blue glycosaminoglycan were more obvious in the experimental group. Conclusion? Autologous platelet-rich fibrin can promote the survival of rabbit ear cartilage after transplantation.
Key words： platelet-rich fibrin（PRF）; rhinoplasty; ear cartilage transplantation; absorbtion of cartilage; survival of cartilage; cytokines
整形美容行业近年来得到快速发展，其中鼻整形手术成为热门手术之一。鼻整形手术通常应用的手术方式有鼻假体置入术、鼻假体联合耳软骨隆鼻术、肋软骨隆鼻术等[1]。由于单纯假体置入容易引起感染、假体外露、包膜挛缩、透光等并发症[2]，肋软骨隆鼻手术存在血胸、气胸、肋骨骨折、瘢痕形成甚至胸廓畸形等风险[3]，目前鼻假体联合耳软骨隆鼻术最为常用。然而，在临床工作中，术者发现耳软骨移植术后易出现软骨成活不佳、被吸收等问题，导致患者对术后远期鼻部形态不满意。因此，改善耳软骨移植后存活、减少其吸收成为鼻整形手术中急需解决的一大问题。
富血小板纤维蛋白（Platelet-rich fibrin，PRF）是由Choukroun等在2001年发现的第二代血小板浓缩物[4]。PRF能够有效模拟生理状态下血凝块中的纤维蛋白形成过程，避免了免疫排斥和交叉感染的发生，有很好的生物相容性[5]。本课题组通过前期研究发现，PRF能够促进溃疡创面愈合[6]，在骨缺损修复中可以诱导骨组织再生[7]，在脂肪移植中有促进脂肪细胞存活的作用[8]。为进一步探究PRF在耳软骨移植方面是否同样具有良好的应用效果，本实验制作了新西兰大白兔自体耳软骨异位移植模型进行相关实验研究。
1? 材料和方法
1.1 研究对象：12～16周生长雄性新西兰大白兔16只，体重3.2～3.5kg，均购自安徽医科大学实验室，清洁级，普通环境下单笼饲养，遵照安徽医科大学第一附属医院实验动物饲养与使用规定，动物购置后饲养3周。
1.2 实验材料：7%水合氯醛购自青岛宇龙海藻有限公司;2%盐酸利多卡因注射液购自上海朝晖药品有限公司;盐酸金霉素眼膏购自北京双言制药有限公司;4%多聚甲醛固定液购自博士德生物技术有限公司;HE染色试剂购自珠海BASO生物技术有限公司;番红〇染色试剂、阿利新蓝染色试剂购自北京索莱宝科技有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 分组：将每只实验兔双侧耳软骨随机分为对照组与实验组，对照组与实验组标本数均为16。
1.3.2 PRF制备：自实验兔耳中动脉以采血针抽取10ml血置入无菌玻璃干管中，立即以3 000r/min离心10min，可见血液分为三层，上层清亮液体为贫血小板血浆层，中层半透明凝胶状物质为PRF凝胶，底层为破碎红细胞层（见图1）。将试管放入4℃冰箱中冷藏30min后取出，取试管中层凝胶样物质放置于无菌纱布上，轻轻按压挤出水分，使PRF成膜状，PRF膜片即制备完成，备用。
1.3.3 制作兔耳软骨移植模型：将实验兔称重并记录，7%水合氯醛注射液按3ml/kg自兔耳缘静脉麻醉，麻醉成功后将兔双侧耳、颈背部剃毛备皮。于实验兔双侧耳背面对称部位标记拟取软骨范围，尽量避开耳缘静脉及中动脉，防止剥离过程损伤血管。标记完成后，常规消毒铺巾，以稀释后浓度为0.5%的利多卡因溶液沿标记线行皮下注射起到局部肿胀及麻醉作用，肿胀完成后以11号尖刀片划开皮肤，用剥离子逐步剥离开软骨与皮肤，剥离完毕后以组织剪小心剪下软骨，并去除软骨表面软骨膜，将两侧软骨修剪至大小形状相似、重量为80mg的软骨块（见图2）。自兔背部皮肤以后正中线做两侧对称小切口至浅筋膜层，分离出浅筋膜腔隙，将对照组耳软骨块直接置入左侧背部浅筋膜腔隙内，将制备好的PRF膜片和实验组耳软骨块共同放入右侧背部浅筋膜腔隙内，用丝线逐层缝合手术切口，术区涂抹盐酸金霉素眼膏后处于暴露状态，待麻醉恢复后放入原笼中，使之自由活动，定期观察术区情况。
1.4 观察指标
1.4.1 一般情况及组织大体外观观察：术后观察实验兔活动、进食及手术切口的感染情况，于术后2周、4周、8周、12周以空气针静脉注射各处死4只实验兔，取出移植耳软骨块观察对照组与实验组耳软骨块增大或减小情况。
1.4.2 耳软骨块重量比较：于各时间点将移植耳软骨块取出后去除表面包膜进行称重并记录。
1.4.3 组织学观察：将移植耳软骨块标本置于4%多聚甲醛固定液中进行固定，脱钙、梯度乙醇脱水、石蜡包埋后，切片进行HE染色、番红〇染色、阿利新蓝染色，在光镜下对标本进行观察，了解软骨细胞成活、新生软骨细胞数量及随时间变化等情况。
1.5 统计学分析：数据采用SPSS 23.0统计软件进行统计学分析。先经Levene齐性检验方差满足齐性要求。软骨块重量经过单因素方差分析，两组间比较采用两独立样本t检验，数据以均值±标准差（x?±s）表示，P<0.05为差异有统计学意义。
2? 结果
2.1 一般情况及大体观察：所有实验兔在麻醉完全恢复后均能正常活动及饮食，无死亡，均进入结果分析。实验兔耳部及背部手术切口均未出现感染，于拟定时间取出移植耳软骨块观察，见各组移植耳软骨块表面光滑，边界清晰，2～4周时可见两组耳软骨块均增大，其中实验组增大更明显，8～12周两组耳软骨块均有所减小，其中对照组减小更为明显。见图3。
注：A～D.对照组分别于2周、4周、8周、12周取出的移植耳软骨块;E～H.实验组分别于2周、4周、8周、12周取出的移植耳軟骨块
2.2 耳软骨块重量比较：由表1可知，2～4周时耳软骨块重量增加，8～12周时耳软骨块重量减少，各时间点实验组耳软骨块重量均大于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）与大体观察结果相符。由此可知，PRF在术后12周内可以促进兔耳软骨移植后成活，减少其吸收。
2.3 组织学观察：对照组：2周时于耳软骨块边缘出现新生软骨细胞，其体积较小;4周、8周时见新生软骨细胞形态逐渐增大、数量逐渐减少，12周时几乎无新生软骨细胞存在。实验组：2周时于耳软骨块边缘出现大量新生软骨细胞，其体积小、形态不规则呈多形性、排列紊乱;4周、8周时新生软骨细胞增大，形态趋向成熟，排列较前规则;12周时可见组织新生软骨细胞较2周时减少，但仍存在明显新生软骨细胞。
实验组与对照组相比：各取材时间点在相同显微倍数、同一个视野下实验组软骨细胞明显多于对照组，其中新生软骨细胞也多于对照组（见图4）;在番红〇染色中，实验组与对照组均有明显异染性软骨基质，实验组异染性软骨基质更多（见图5）;在阿利新蓝染色中，可见实验组蓝色的糖胺聚糖较对照组更明显（见图6）。
3? 讨论
鼻假体联合耳软骨隆鼻术虽因其具有软骨获取简单、损伤较小、术后并发症少等优点而得到广泛应用，但仍然存在着软骨成活不佳、被吸收等问题。耳软骨移植后被吸收的原因目前尚不明确，廖俊琳等[9]通过研究提出软骨吸收的原因可能为：①软骨块脱离软骨膜保护后缺乏营养供应;②自身抗原的暴露，被软骨基质保护而未被机体识别的软骨细胞暴露于免疫系统，免疫系统激活后发生清除作用。为进一步解决软骨移植后被吸收的问题，有学者通过动物实验研究发现脂肪干细胞与软骨颗粒混合、使用人类羊膜包裹软骨可以减少软骨吸收[10]，但由于脂肪干细胞培养复杂、人类羊膜获取困难等原因限制了其临床应用。
PRF是一种富含纤维蛋白、白细胞和大量生长因子的第二代血小板浓缩物。在电镜下呈现出三分子立体疏松网格状结构，类似于天然血凝块，其疏松的结构和较大的空隙有利于细胞因子的留存、细胞生长及移行，从而延长细胞因子的释放和作用时间[11]。PRF活化后缓慢释放出多种细胞因子，如转化生长因子-β、血小板源性生长因子和血管内皮生长因子等[12]。多种生长因子联合作用可提高软组织修复能力，减轻炎症反应和水肿[13]，促进软骨细胞增殖生长以及软骨组织细胞外基质生成[14]，此外，其还可以诱导骨间质干细胞增殖分化，提高成骨细胞蛋白激酶和骨保护素表达，促进成骨细胞增殖和分化及新骨形成能力[15-16]。国内目前对PRF的研究主要集中于牙周组织及软骨缺损修复等方面，如PRF联合引导骨再生技术有利于促进牙周病颌骨缺损患者植骨治疗后骨组织修复及新生[17];PRF联合自体软骨颗粒能够有效修复和缩小软骨缺损[18]。然而，PRF在鼻整形手术方面的应用尚无文献报道。
在本研究中，课题组制作了兔自体耳软骨异位移植模型，即将兔双侧耳软骨块随机分为对照组和实验组，分别将单纯耳软骨块、PRF联合耳软骨块移置入背部浅筋膜腔隙内，并在不同时间点取出耳软骨块进行大体观察、重量比较并进行统计学分析和组织学观察。结果表明，PRF在耳软骨移植术后12周内可有效减少耳软骨块吸收，促进耳软骨块成活。课题组结合相关文献分析后认为其机制可能有：①PRF释放血管内皮生长因子促进新生血管形成进而为移植耳软骨提供营养;②多种细胞因子共同作用减轻炎症反应从而降低了因周围组织水肿对移植耳软骨产生的挤压应力。本实验亦存在不足需要改进之处：①由于时间限制，在本实验中未对以上所述可能的机制进行相关实验验证;②本次实验最长取材时间点为12周，12周后两组耳软骨块重量将如何变化尚不可知;③PRF制备需要新鲜血液，单次抽取血液量与制备出PRF量非正相关，因此限制了PRF在临床上的单次大量应用。在后续研究中本课题组将进一步完善对机制的研究，并探究PRF的保存方法，以期为临床开展更加完善的鼻整形手术提供新的理论依据。
综上所述，自体富血小板纤维蛋白可以在耳软骨移植术后12周内减少耳软骨吸收并促进其成活，并且因其具有抗感染、减轻炎症反应和水肿的作用，可以考虑将其应用于耳软骨移植鼻整形术中以维持鼻部形态，提高患者满意度。
[参考文献]
[1]顾天一，王克明，马继光.鼻整形植入材料的优缺点及进展[J].中国美容整形外科杂志，2019，30（9）：569-573.
[2]Kim IS.Augmentation rhinoplasty using silicone implants[J].Facial Plast Surg Clin North Am，2018，26（3）：285-293.
[3]Ho OYM，Ku PKM.Rhinoplasty outcomes and trends[J].Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg，2019，27（4）：280-286.
[4]Dohan DM，Choukroun J，Diss A，et al.Platelet-rich fibrin （PRF）：a second-generation platelet concentrate Part Ⅱ： technological concepts and evolution[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2006，101（3）：e37-44.
[5]Dohan DM，Choukroun J，Diss A，et al.Platelet-rich fibrin （PRF）：a second-generation platelet concentrate Part Ⅱ： platelet-related biologic features[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2006，101（3）：e45-50.
[6]汪新偉，荣洁琳，蒋思静，等.富血小板纤维蛋白在治疗糖尿病兔皮肤溃疡中的实验研究[J].安徽医科大学学报，2017，52（7）：983-987.
[7]蒋思静，荣洁琳，汪新伟，等.自体骨联合富血小板纤维蛋白在修复牙槽嵴裂中的临床应用[J].安徽医科大学学报，2018，53（5）：805-808.
[8]柳芳，赵宇，马莉，等.改良型PRF与普通型PRF在脂肪移植应用中的实验对比研究[J].中国美容医学，2019，28（11）：82-85.
[9]廖俊琳，周建大.自体颗粒软骨在鼻整形中的研究应用进展[J].中国美容医学，2015，24（15）：78-81.
[10]Motamed S，Mohammadi Torbati P，Zaferani Arani H，et al.Effects of the human amniotic membrane on the cartilage graft： prognosis and absorption in white rabbits[J].World J Plast Surg，2019，8（2）：219-228.
[11]Dohan Ehrenfest DM，Del Corso M，Diss A，et al.Three-dimensional architecture and cell composition of a Choukroun's platelet-rich fibrin clot and membrane[J].J Periodontol，2010，81（4）：546-555.
[12]Dohan Ehrenfest DM，Pinto NR，Pereda A，et al.The impact of the centrifuge characteristics and centrifugation protocols on the cells， growth factors， and fibrin architecture of a leukocyte- and platelet-rich fibrin （L-PRF） clot and membrane[J].Platelets，2018，29（2）：171-184.
[13]Strauss FJ，Nasirzade J，Kargarpoor Z，et al.Effect of platelet-rich fibrin on cell proliferation， migration， differentiation， inflammation， and osteoclastogenesis： a systematic review of in vitro studies[J].Clin Oral Investig，2020，24（2）：569-584.
[14]Tang X，Chen F，Lin Q，et al.Bone marrow mesenchymal stem cells repair the hippocampal neurons and increase the expression of IGF-1 after cardiac arrest in rats[J].Exp Ther Med，2017，14（5）：4312-4320.
[15]Ju X，Xue D，Wang T，et al.Catalpol promotes the survival and VEGF secretion of bone marrow-derived stem cells and their role in myocardial repair after myocardial infarction in rats[J].Cardiovasc Toxicol，2018，18（5）：471-481.
[16]Choukroun J，Diss A，Simonpieri A，et al.Platelet-rich fibrin （PRF）： a second-generation platelet concentrate Part IV： clinical effects on tissue healing[J].Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2006，101（3）：e56-60.
[17]謝红帼，姚琴，卢骁鹏，等.富血小板纤维蛋白联合引导骨再生技术治疗牙周病颌骨缺损[J].中国新药与临床杂志，2019，38（8）：489-493.
[18]王秀，张正文，谢锋.富血小板纤维蛋白联合自体软骨颗粒修复兔耳软骨缺损[J].中国美容医学，2017，26（12）：56-60.
[收稿日期]2020-03-20
本文引用格式：高堂俊，赵宇，吴亮亮，等.富血小板纤维蛋白对兔耳软骨移植成活情况的影响[J].中国美容医学，2020，29（12）：97-101.
