乳制品及其相关食品中乳铁蛋白常用检测方法
张君超 胡素丽
随着经济的快速发展，人们对食物营养的需求日益旺盛。乳铁蛋白因具有抗菌、抗氧化、抗癌、促进肠道发育、促进铁吸收，以及调节免疫系统等功能，故在乳制品及相关的婴幼儿配方食品、特殊医学用途配方食品、特殊膳食食品、保健食品等生产中均有不同程度的添加。随着“国家优质乳工程”的实施，众多企业对巴氏杀菌乳工艺进行改进，从而保留了更多天然活性乳铁蛋白。然而，我国尚未建立完善的乳制品及相关食品中乳铁蛋白添加量与保留量的统一检测标准，导致生产者、监管者和消费者无法在同一尺度上进行衡量判别。本文通过对乳制品及相关食品中乳铁蛋白现有的常用检测方法进行汇总，对不同检测方法的适用样本及检测性能进行分析，提出了不同乳制品及相关食品中乳铁蛋白检测方法的建议，旨在为乳制品及相关食品中乳铁蛋白检测的标准化提供思考与建议。
1 乳铁蛋白的检测需求
乳铁蛋白（lactoferrin，LF）是哺乳动物乳汁中存在的一种天然非血红素铁结合糖蛋白，具有强大的生物功能——抗菌、抗氧化、抗癌、促进肠道发育和铁吸收，以及调节免疫系统等。因乳铁蛋白具有优质生物功能，免疫力较低的人群、患有感染性疾病的人群、具有骨质疏松风险的人群，以及缺铁性贫血人群均对于乳铁蛋白的补充有所需求。
以婴幼儿和儿童为例，现有的研究证据表明，牛乳铁蛋白对婴幼儿和儿童腹泻、新生儿坏死性小肠结肠炎、新生儿呼吸道疾病、新生儿败血症、儿童幽门螺旋杆菌感染等均有一定的预防和辅助治疗作用，且对婴幼儿贫血具有改善作用，并对婴幼儿生长发育有促进作用。
母乳是婴幼儿获得乳铁蛋白的主要来源，而无法正常进行母乳哺育的婴幼儿和其他人群获得乳铁蛋白的主要来源则为其他乳制品及相关食品。因为牛乳铁蛋白和人乳铁蛋白的氨基酸序列同源性达69%，且具有相似的生物活性，所以是目前最易获取的乳铁蛋白来源之一。但鲜牛乳中的乳铁蛋白含量仅为0.02～0.2g/L，约为母乳中的乳铁蛋白含量（0.44～4.4g/L）的1/20，且鲜牛乳中的乳铁蛋白会随着加工过程中加热时间、pH值、铁饱和度及压力等因素的变化而降低活性与功能。因此，大部分企业会在乳制品及相关食品中添加易获得的牛乳铁蛋白，其目前已被应用于婴幼儿配方食品、特殊医学用途配方食品、特殊膳食食品及保健食品中。由于乳铁蛋白原料价格较高，一些不法企业少添加或不添加乳铁蛋白，使产品与宣传标示的添加量严重不符，侵犯了消费者的利益。牛乳铁蛋白作为生鲜牛乳中的天然成分，更多地保留其天然营养活性也是目前关注的技术重点，“国家优质乳工程”明确提出优质巴氏杀菌乳生物活性物质的指标要求——乳铁蛋白≥25mg/L。如此看来，对乳制品及相关食品中乳铁蛋白进行检测显得尤为重要，其不仅能对标示添加量进行控制，还可对巴氏杀菌工艺进行精准控制。
2 乳铁蛋白的常用检测技术
目前，乳制品及相关食品中的牛乳铁蛋白检测尚无国家强制性标准，现有的常用检测方法按照检测原理可分为免疫学分析法（免疫扩散法、酶联免疫法、免疫层析快速检测法）和色谱分析法（高效液相色谱法、高效液相-质谱联用法/超高效液相-质谱联用法、毛细管电泳法、凝胶电泳检测方法）。此外，分光光度法、离子共振法、生物传感测定法、核酸适配体法等也有所报道。
2.1免疫学检测
免疫学检测是基于抗原抗体特异性反应的检测方法，已报道的乳铁蛋白检测方法有随机免疫扩散法、放射免疫法、酶联免疫法、免疫层析快速检测方法等。免疫学检测的关键在于抗体的特异性，即乳铁蛋白抗体与乳制品及相关食品中其他酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白等成分无交叉反应。
2.1.1 免疫扩散法
免疫扩散法以抗原-抗体的免疫沉淀反应为基础，以琼脂为惰性载体，通过沉淀带与乳铁蛋白标准浓度的关系即可定量测定待测样品中乳铁蛋白的含量。
免疫扩散法可用于检测婴幼儿配方奶粉中乳铁蛋白的含量。该方法成本相对低廉，但操作步骤复杂，检测耗时大于48h，且检测结果需通过人为测量沉淀环直径进而容易产生误差，检测范围在50～200mg/L之间，故在实际检测中的应用并不广泛。
2.1.2 酶联免疫法
酶联免疫法是在抗原与抗体特异性结合的基础上通过酶标记及显色剂判断最终结果的常用检测方法。乳铁蛋白的分子量为70～80kD，因此常采用酶联免疫双抗夹心法进行测定——在酶标微孔上预包被牛乳铁蛋白抗体，预包被的牛乳铁蛋白抗體与酶标抗体（酶标物）同时与样本中的牛乳铁蛋白结合形成抗体-牛乳铁蛋白-酶标抗体复合物，经TMB底物显色，样本吸光值与牛乳铁蛋白的含量呈正相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中牛乳铁蛋白的含量。
由于抗原与抗体的特异性及酶催化效率，酶联免疫方法具有反应灵敏、特异性强的特点。据报道，对于乳制品及相关食品中乳铁蛋白的检测，乳粉检出限可达20mg/kg，液体乳检出限可达到0.1mg/kg。目前，酶联免疫法商品化试剂盒的研发技术已相对成熟，故使检测操作更为简便，能够对大量样本进行检测，但不同厂家的试剂盒、实验人员的操作经验和熟练程度等因素对检测结果的准确度有所影响。由于婴幼儿配方食品、特殊医学用途配方食品、特殊膳食食品、保健食品中相关乳制品中乳铁蛋白的添加量较高，且不同厂家之间差异较大，因此检测时需将样本稀释在试剂盒的线性范围内，使稀释倍数提升2000～4000倍;同时，不同厂家之间的配方也有所不同，其他元素的干扰较多、样本前处理方法不当等都会造成检测结果的差异。为减少误差，保障检测结果的准确性，对于同一样本的检测需要定期对试剂盒进行质控和回收试验，建议每次对不同样品进行检测时都要进行随行质控或回收试验。
2.1.3 免疫层析快速检测
免疫层析快速检测法的特点是在抗原与抗体特异性结合的基础上利用标记技术和层析反应，达到快速、准确检测待检物的目的。对于简单样本液体乳而言，该方法不需要进行前处理即可对大量样本中的目标物质进行快速筛查，具有简便快速的优点。乳铁蛋白免疫层析快速检测法的检测限最低可达2.4μg/L，具有灵敏度高的特点，但该方法因存在样本基质差异问题和假阳性的风险，不适用于其他成分复杂乳制品及相关食品的检测，也不适用于执法机构进行判别确证。因此，应根据检测特点选取合适检测限的免疫层析快速检测产品用于企业对巴氏杀菌工艺控制的快速判别。
2.2 色谱法检测
色谱法检测是利用不同的物质在固定性和流动相两相间的分配不同，从而达到待测物分离的目的。目前报道的乳铁蛋白检测方法有高效液相色谱法、高效液相-质谱联用法/超高效液相-质谱联用法、毛细管电泳法、凝胶电泳检测方法等。
2.2.1 高效液相色谱法
高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是利用不同的色谱柱对不同组分因分配系数及吸附力大小的不同而被分离，并被特定检测器识别的定量检测技术。HPLC方法因具有反应灵敏、结果准确、重复性好等优点，在众多乳铁蛋白检测方法中已被作为团体标准公布实施，同时也被作为食品中乳铁蛋白测定的国家标准征求意见稿中的第一法。此方法对于液态乳样品的检测定量限可达到5～20mg/kg，乳粉等固态样品的定量限可达到10～100mg/kg。但因受复杂基质所影响，HPLC方法在其他样本检测中的定量限不尽相同，如在特殊医学用途婴儿配方食品中的定量限能够达到150mg/kg。HPLC方法的实际应用并不广泛，主要原因在于仪器昂贵、操作相对复杂、对实验人员要求较高等。HPLC操作中复杂度较高的主要环节是样品前处理，因其对样品纯度要求较高，且乳制品及相关食品的基质成分相当复杂，故无法直接进行液相色谱检测，目前常用肝素亲和柱净化乳制品及相关食品中乳铁蛋白的检测，而肝素亲和柱的使用又增加了样品的检测成本。
2.2.2 高效液相色谱-串联质谱法/超高效液相色谱-串联质谱法
质谱仪通过测量特定离子的质核比来对待测物进行准确定性，并能与高效液相色谱/超高效液相色谱等联用来达到精确定量的目的。牛乳铁蛋白的分子质量为70～80kD，其检测是将蛋白质组学技术、同位素标记技术与高效液相色谱-质谱法/超高效液相色谱-串联质谱法相结合进行，即先利用碱性胰蛋白酶水解牛乳铁蛋白确定乳铁蛋白的特异性肽段，并配合稳定同位素肽段作为内标，进而实现乳铁蛋白定量检测。该类方法抗干扰能力强、灵敏度极高、重复性好，其中，高效液相色谱-串联质谱法的乳铁蛋白定量限可达5mg/kg，超高效液相色譜-串联质谱法的乳铁蛋白定量限可达0.077～0.137mg/kg。此方法适用于多种样本中牛乳铁蛋白的含量测定，同时也能对其他来源的乳铁蛋白进行准确鉴定。但这一方法的前处理过程需将乳铁蛋白酶解，而活性与非活性乳铁蛋白均可参与此过程，致使最终的检测结果为样本中乳铁蛋白的总量，并不能区分样本中活性乳铁蛋白与非活性乳铁蛋白。此外，该方法使用的设备相比HPLC更加昂贵，对操作人员的专业性要求也更高，因此适用性并不广泛。
2.2.3 毛细管电泳法
毛细管电泳法是以毛细管为分离通道、高压直流电场为驱动力的液相分离技术，也是实验室常用的分离与检测蛋白质的手段，该方法操作过程相对简单，检测乳铁蛋白的定量限可达50mg/kg。但是，采用该方法易使乳铁蛋白被毛细管壁吸附，导致检测重复性差。通过体系优化可以解决此问题，但不适用于乳铁蛋白含量较低的样本检测，仅适用于添加乳铁蛋白含量较多的食品检测。
2.2.4 凝胶电泳检测法
凝胶电泳检测法是利用不同的DNA探针在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率不同，从而对目标物进行分离检测的方法。在乳铁蛋白检测领域，选择一种DNA探针分子与乳铁蛋白特异性结合，根据DNA-乳铁蛋白结合物在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率与条带的灰度值便可对样本中乳铁蛋白进行定量检测。此方法使样本中的乳铁蛋白在高温条件下与DNA探针进行特异性结合，通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，奶粉检出限可达74mg/kg，生乳等的检出限可达10mg/L，且无需借助色谱/质谱/光谱等大型仪器，成本低、通量高，但操作相对繁琐。
3 小结
综上所述，不同检测方法有着各自的优缺点，监管者、生产者可根据样本类型及检验需求选择合适的检验方法，但仍迫切需要建立统一的国家标准，让不同检验方法拥有统一的对比标准。
