基于络合反应纳米自聚集的荧光/表面增强拉曼光谱双传感模式检测锌离子

    郑思倾　李丹　邓维　司文帅　白冰

    

    

    

    摘 要 纳米光学探针具有独特的结构特征和光学特性， 受到广泛的关注。本研究合成了一种新的荧光/表面增强拉曼散射（SERS）双模式纳米光学探针， 利用羟基苯甲酸衍生物（NAMH）的酚羟基和席夫碱对Zn2+具有优良亲和力的特性， 构建了NAMH修饰银纳米颗粒（AgNPs@NAMH）探针， AgNPs@NAMH与Zn2+之间发生特异的络合作用， 诱导荧光信号猝灭， 可用于复杂样本中Zn2+的荧光检测， 检出限为0.32 nmol/L。此外， 络合反应引发AgNPs发生自聚集， 可实现对Zn2+的超灵敏SERS检测， 检出限为0.68 pmol/L。本方法具有操作简单、快速、高灵敏和高选择性等优点， 为环境污染物的即时检测提供了技术支持。

    关键词 荧光; 表面增强拉曼光谱; 络合反应; 锌离子

    1 引 言

    微量锌离子（Zn2+）参与机体内多种酶合成[1]， 适量的Zn2+对控制血糖有积极作用[2]， Zn2+缺乏或过量可能引起特定的免疫反应[3]。因此， 开发高灵敏和高特异性的Zn2+快速检测方法意义重大。传统的Zn2+快速检测方法包括比色法和电化学分析法等， 这些方法具有操作简便、测定快速和分析范围广等优势， 但是这些方法大多选择性低， 且对环境有污染 [4]。

    荧光分析法具有灵敏度高、测定快速和可视化等特点， 被广泛用于Zn2+的现场快速检测[5]， 但易受到复杂基体的干扰。表面增强拉曼光谱（SERS）具有“指纹”特性， 水的干扰小， 因而在污染物现场检测领域备受关注[6， 7]， 但是， 金属离子的拉曼截面积小， 表面亲和力弱， 限制了SERS在环境检测中的应用[8， 9]。结合荧光和SERS方法的特点， 开发兼具荧光和SERS性能的纳米光学探针有助于实现Zn2+的快速、准确检测。目前， 文献报道的多模式分析方法多是通过比色法和荧光法实现Zn2+的检测， 但通常具有检测浓度范围窄和背景干扰大等不足[10]。Velmurugan等[11]设计的喹啉苯并咪唑共轭物对Zn2+显示出高选择性， 但检出限仅为1.5×10-5 mol/L。Ghorai等[12]制备了一种用于Zn2+检测的化学探针， 实现了对Zn2+的灵敏检测， 但是不能有效区分Cu2+和Zn2+。因此， 开发一种高灵敏、高特异性的Zn2+多模式纳米光学探针具有重要的应用价值。

    本研究合成了4， 4′-（（（1E， 1′E）-（萘-2， 6-二基双（氮杂亚烯基））双（甲烷亚基））双（3-羟基苯甲酸）（NAMH）修饰银纳米粒子（AgNPs）的纳米探针， 基于纳米探针与Zn2+之间的络合反应， 可利用荧光和SERS双传感模式实现Zn2+的分析检测。本方法与现有分析方法[13， 14]比较， 一方面可根据荧光和SERS信号的变化， 实现亚pmol/L级的Zn2+快速检测; 另一方面， 两种检测手段可以单独或合并使用， 从而为现场检测提供精准可靠的分析结果， 因而有效降低了假阳性和假阴性结果的产生。

    2 实验部分

    2.1 仪器与试剂

    UV-2600紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）; F97荧光分光光度计（上海棱光技术有限公司）; BWS415-785S便携式拉曼光谱仪（美国必达泰克公司）; Master-S15超纯水机（上海泰坦科技股份有限公司）; 1500D单反照相机（日本尼康公司）。

    AgNO3、柠檬酸钠、2， 6-二氨基萘、4-甲酰基-3-羟基苯甲酸、L-半胱氨酸、KH2PO4、ZnCl2（分析纯， 阿拉丁试剂（上海）有限公司）; 其它试剂均为分析纯; 实验用水为超纯水（18 MΩ·cm）。

    2.2 实验方法

    2.2.1 羟基苯甲酸衍生物（NAMH）的合成 利用改进的文献[15]的方法制备NAMH。首先， 将2， 6-二氨基萘（1.58 mg， 10 μmol）和4-甲酰基-3-羟基苯甲酸（3.32 mg， 20 μmol）溶于40 mL无水乙醇中， 60℃搅拌反应12 h。用二氯甲烷对产物进行萃取， 将有机层用无水Na2SO4干燥， 旋转蒸发， 得到粗产物， 通过硅胶柱色谱法纯化， 以二氯甲烷-乙醇（95∶5， V/V）作为洗脱剂， 所得粗产物为橙黄色固体。1H NMR （501 MHz， DMSO） δ 12.24 （s， 2H）， 9.15 （s， 2H）， 8.26 （d， J=9.0 Hz， 2H）， 8.10 （d， J=8.3 Hz， 2H）， 8.01 （d， J=9.0 Hz， 2H）， 7.58 （d， J=8.1 Hz， 2H）， 7.51 （t， J=7.6 Hz， 2H）， 7.05 （d， J=8.4 Hz， 2H）（1H NMR圖见电子版文后支持信息图S1）。

    2.2.2 NAMH修饰银纳米粒子（AgNPs@NAMH）的制备 通过配体交换法合成AgNPs@NAMH。首先， 将1 mL AgNPs（合成方法见电子版文后支持信息）分散在5 mL水中， 滴加1 μmol/L L-半胱氨酸（0.1 mmol）并剧烈搅拌反应12 h， 以8000 r/min离心5 min， 除去过量的L-半胱氨酸。然后， 将纯化的AgNPs@L-Cys重新分散在1 mL水中。将1 mL AgNPs@L-Cys和1 mL NAMH（0.5 mmol）混合， 在室温下反应24 h， 8000 r/min离心10 min， 以除去过量的NAMH， 沉淀物重新分散在5 mL乙醇中， 在4℃下保存。根据朗伯比尔定律[16]， 通过AgNPs的粒子浓度估算AgNPs@NAMH的浓度。

    2.2.3 荧光光谱法和SERS检测Zn2+ AgNPs@NAMH以磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L， pH 7.0）稀释至10 μmol/L， 加入10 μL不同浓度的ZnCl2溶液。所得混合物在25℃下反应10 min， 然后采用荧光和SERS法测定。当进行荧光检测时， 用荧光分光光度计记录混合物的荧光光谱变化（激发波长380 nm， 狭缝宽度5 nm）， 单反相机记录在365 nm激发下的荧光图像。SERS测量在便携式拉曼光谱仪上进行， 测试条件：785 nm激光（10 mW）， 积分时间30 s， 放大倍数/数值孔径为10 ×/0.25的显微物镜聚焦。

    2.2.4 实际样品检测 自来水、湖水、海水和土壤取自学校及周边， 自来水、湖水、海水通过0.22 μm的滤膜除去不溶物， 土壤样本（5 g）首先用50 mL丙酮洗涤两次， 然后用水冲洗， 并在30℃下干燥。称取1.0 g土壤， 用100 mL HNO3（63%， m/V）和50 mL H2O2（30%， m/V）溶解， 在（150±5）℃下反应2 h， 然后赶酸至近干， 用0.22 μm聚四氟乙烯滤膜除去不溶物， 取滤液5 mL， 用水定容至50 mL， 作为样品溶液。采用荧光和SERS光谱法分析样品溶液。

    3 结果与讨论

    3.1 AgNPs@NAMH的合成与表征

    AgNPs@NAMH纳米探针合成过程如图1所示， 4-甲酰基-3-羟基苯甲酸（FAH）的醛基与2， 6-二氨基萘（DAN）的氨基共价键合得到产物（NAMH）， 具有强的金属离子络合能力和较大的拉曼截面， 可用作Zn2+的探针分子。

    AgNPs@NAMH的吸收光谱如电子版文后支持信息图S2所示， 在280和356 nm具有明显的紫外吸收峰， 分别归属于CN键和萘环的吸收峰[17]， 402 nm处的吸收峰来源于AgNPs的局域表面等离子体吸收[18]。与两种原料FAH和DAN的荧光光谱比较， 产物NAMH在537 nm 处产生了一个新峰（图2A）， 该峰可以归属于双萘基系[19]。此外， AgNPs@NAMH的拉曼光谱出现了CN（1616 cm-1）和羰基（1922 cm-1）振动的特征峰（图2B曲线c）[20]。以上结果表明， 已成功制备AgNPs@NAMH。

    3.2 AgNPs@NAMH对Zn2+的荧光和SERS的响应机理

    考察了AgNPs@NAMH对Zn2+的荧光和SERS响应。由图3A所见， AgNPs@NAMH 与Zn2+反应后， 探针在537 nm的荧光强度（F537 nm）明显降低， 同时伴随探针在1616 cm-1处拉曼信号的降低和1922 cm-1处拉曼信号的升高（图3B）。 结果表明， 此纳米探针对Zn2+有良好的荧光和SERS响应。为了研究Zn2+对AgNPs@NAMH 的刺激响应机理， 考察了共存金属离子对反应体系的荧光和SERS响应。如图3C和3D所示， 当单独加入干扰离子， F537 nm、1922与1616 cm-1拉曼峰强度比值（I1922/I1616）并未出现明显的变化; 当同时加入干扰物与Zn2+时， F537 nm明显降低， 并且I1922/I1616增加， 表明AgNPs@NAMH对Zn2+具有高特异性。

    Zn2+和NAMH的Job分析如图4A所示， 最大摩尔分数为0.5， 表明Zn2+和NAMH之间的化学计量比为1∶1。荧光滴定结果（图4B）表明， NAMH-Zn2+的缔合常数（Ka）为1.48×107 L/mol[21]， 表明此纳米探针与Zn2+具有较强的结合能力。Zn2+作为一种顺磁性离子， 可通过与荧光团形成络合物发生电子或能量转移， 进而强烈抑制纳米探针的荧光发射[22， 23]。此外， Zn2+与CN和酚羟基之间具有较高的亲和力和较快的结合动力学过程， 从而可实现Zn2+与其它金属离子的区分检测[24]。另外， NAMH与Zn2+的络合作用会诱导AgNPs@NAMH发生纳米颗粒自聚集， 并产生大量的“热点”[25]， 从而使体系的拉曼光谱信号得到极大增强。以上结果表明， AgNPs@NAMH对Zn2+具有较高的荧光和SERS选择性， 有望用于复杂样品中Zn2+的现场快速筛查。

    3.3 基于AgNPs@NAMH的Zn2+荧光和SERS双传感检测

    由于Zn2+加入前后， 反应体系的F537 nm和I1922/I1616对于Zn2+具有明显响应（图3A和3B）， 本研究考察了不同实验条件对反应体系F537 nm和I1922/I1616的影响。当AgNPs@NAMH浓度为10 μmol/L、 AgNPs与NAMH的摩尔比为1∶5000时（电子版文后支持信息图S3和S4）， F537 nm和I1922/I1616达到最大值， 并保持稳定， 这可能是由于NAMH在AgNPs表面吸附达到饱和。此外， AgNPs@NAMH与Zn2+之间的络合作用在10 min内反应基本完成（电子版文后支持信息图S5）， 因此， 选择10 min作为Zn2+检测时间。反应体系pH=7.0时， 可获得最佳的荧光和SERS响应（电子版文后支持信息图S6）， 这可能是由于弱酸性条件（pH≤6.0）下， NAMH的氮原子发生质子化， 阻碍了AgNPs@NAMH-Zn2+复合物的形成， 而弱碱性（pH 8.0～10.0）容易诱导Zn2+形成沉淀。AgNPs@NAMH在20～25℃内检测性能相对稳定（电子版文后支持信息图S7）， 因此， 选择在25℃下进行检测。在最佳条件下， 测定了不同浓度的Zn2+存在下探针的荧光光谱。随着Zn2+浓度逐渐增大， AgNPs@NAMH的F537 nm随之降低（图5A）， F537 nm与Zn2+浓度的对数呈线性关系（图5B）， 线性方程为F537nm=-576.05×lg[Zn2+]+203.63， 相关系数 R2=0.99， 检出限为0.32 nmol/L（S/N=3）。

    为探究AgNPs@NAMH对Zn2+的SERS检测性能， 测试了不同浓度Zn2+存在下AgNPs@NAMH的SERS光谱。由图5C可见， 随著Zn2+浓度增加， 1922 cm-1的拉曼峰强度随之增加， 1616 cm-1的拉曼峰强度逐渐降低， 这可能是由于纳米颗粒聚集产生大量“热点”， 使得1922 cm-1的SERS信号增加， 即使Zn2+浓度降至10-6 μmol/L， 该SERS信号也可以被识别， 1616 cm-1处拉曼峰降低可能是NAMH表面取向变化和分子极化率张量变化所致[26， 27]。因此， I1922/I1616可作为定量评估AgNPs@NAMH对Zn2+的SERS检测的特征值。I1922/I1616与Zn2+浓度对数之间具有良好的线性关系（图 5D）， 线性校正曲线方程为I1922/I1616=0.42 lg[Zn2+]+2.09， 检出限为0.68 pmol/L（S/N=3）。

    为了进一步评估AgNPs@NAMH检测Zn2+的重复性， 采集同一探针上10个不同位置的拉曼光谱， 测定结果的相对标准偏差（RSD）为11.7%（电子版文后支持信息图S8）， 表明纳米探针AgNPs@NAMH具有良好的重复性。同时， AgNPs@NAMH还显示出良好的稳定性（电子版文后支持信息图S9）。以上结果表明， AgNPs@NAMH可作为稳定、可靠的荧光和SERS双模纳米探针用于Zn2+的分析检测。与文献报道方法相比， 本方法具有宽的检测范围、低的检出限和较短的检测时间（电子版文后支持信息表S1）， 可以满足复杂样本现场快速检测的需求。

    3.4 实际样品中Zn2+的荧光和SERS双重检测

    为验证AgNPs@NAMH用于现场检测Zn2+的可行性， 考察了荧光和SERS双模式方法分析复杂环境样品中Zn2+的检测性能， 结果见表1。 荧光和SERS方法的回收率为82.8%～116.2%， RSD小于15%; 此外， 荧光和SERS方法的分析结果与电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）法的结果一致。

    4 结 论

    建立了一种基于AgNPs@NAMH的Zn2+检测方法， 通过Zn2+诱导AgNPs@NAMH自聚集， 实现Zn2+的荧光和SERS双传感检测。此方法结合了荧光法和SERS方法的优势， 可通过裸眼直接观察， 实现Zn2+的快速定性和半定量分析; 另一方面， 通过测量荧光和SERS双模式的信号进行Zn2+含量的准确分析， 可用于复杂样本中Zn2+的现场快速筛查和精准分析， 有望在环境分析领域得到广泛应用。

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    Fluorescence and Surface Enhanced Raman Scattering Dual

    Modal Detection of Zn2+ Based on Complexation

    Reaction-Induced Self-Aggregation of Nanoparticles

    ZHENG Si-Qing1， LI Dan*1， DENG Wei1， SI Wen-Shuai2， BAI Bing2

    1（School of Chemical and Environmental Engineering， Shanghai Institute of Technology， Shanghai 201418， China）

    2（Institute for Agro-Food Standards and Testing Technology， Shanghai Academy

    of Agricultural Sciences， Shanghai 201403， China）

    Abstract Optical nanoprobes have attracted extensive attention in area of analytical chemistry because of their unique structural characteristics and optical properties. In this study， a novel fluorescence/surface-enhanced Raman scattering （SERS） dual-modal nanoprobe was developed. The phenolic hydroxyl group and Schiff base of hydroxybenzoic acid derivative （NAMH） exhibited a preferential affinity towards Zn2+. The complexation between AgNPs@NAMH and Zn2+ induced the quenching of the fluorescent signal of NAMH， thus enabling the fluorescent detection of Zn2+ in complex samples with a detection limit of 0.32 nmol/L. Moreover， the Zn2+-triggered AgNPs aggregation led to the formation of abundant “hot spots” among NPs， which could be used for SERS analysis of Zn2+ with a detection limit of 0.68 pmol/L. This method had a number of advantages over conventional approaches in simplicity of operation， rapidity， high sensitivity and high selectivity， and provided new technical support for the immediate detection of environmental pollutants.

    Keywords Fluorescence; Surface-enhanced Raman scattering; Complexation reaction; Zinc ion

    （Received 25 May 2020; accepted 13 August 2020）

    This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 21507089， 21976123） and the Science and Technology Commission of Shanghai Municipality （No. 19391901800）.

    2020-05-25收稿; 2020-08-13接受

    本文系國家自然科学基金项目（Nos. 21507089， 21976123）和上海市科学技术委员会农业领域项目（No.19391901800）资助

    * E-mail： dany@sit.edu.cn