四妙勇安汤改善冠心病痰瘀互结证大鼠心肌损伤的研究
王琛 王亚红
摘要 目的：探讨四妙勇安汤对冠心病痰瘀互结证大鼠的心肌保护作用及机制。方法：建立冠心病痰瘀互结证大鼠模型，随机分为正常对照组、模型组、四妙勇安汤大剂量组、四妙勇安汤中剂量组、四妙勇安汤小剂量组，相应干预后，处理动物。检测血脂三项、凝血三项、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-8（IL-8）、内皮素-1（ET-1）及可溶性血管细胞黏附分子-1（sICAM-1）;采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡率;Western blotting法检测心肌组织凋亡及自噬相关蛋白的表达。结果：与模型组比较，四妙勇安汤可降低血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）及低密度脂蛋白（LDL）含量（P<0.05），同时可增加血浆活化部分凝血活酶时间（APTT）（P<0.05）;降低血清炎症介质TNF-α、IL-8及ET-1、sICAM-1含量（P<0.05）;四妙勇安汤干预组可有效降低心肌细胞凋亡率、促进抗凋亡蛋白BCL-2及抑制促凋亡蛋白BAX的表達;并且抑制自噬相关蛋白LC3、Beclin-1表达，与模型组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：四妙勇安汤具有改善冠心病痰瘀互结证大鼠血脂、血凝及内皮功能等作用，具有保护受损心肌的作用，其机制可能与抑制自噬引起的心肌细胞凋亡有关。
关键词 四妙勇安汤;冠心病;痰瘀互结证;大鼠模型;心肌损伤;保护作用;自噬;细胞凋亡
Abstract Objective：To explore the myocardial protective effects and mechanism of Simiao Yongan Decoction on rats with coronary heart disease with mutual syndrome of phlegm and blood stasis.Methods：The rat model of coronary heart disease of phlegm and blood stasis syndrome was established and were randomly divided into a normal control group，a model group，Simiao Yongan Decoction of high，middle and small dose group.After the corresponding intervention，we handled the animals，detected 3 blood lipids，3 blood coagulation，tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin-8（IL-8），endothelin-1（ET-1） and soluble vascular cell adhesion molecule-1（sICAM-1）; TUNEL method was used to detect myocardial cell apoptosis rate; Western blotting method was used to detect myocardial tissue apoptosis and the expression of autophagy-related proteins.Results：Compared with the model group，Simiao Yongan Decoction groups can reduce serum total cholesterol，triglycerides and low-density lipoprotein content（P<0.05），and increase plasma activated partial thromboplastin time（APTT）（P<0.05）; reduce serum inflammatory factors TNF-α，IL-8 and ET-1，sICAM-1 content（P<0.05）; Simiao Yongan Decoction intervention group can effectively reduce the rate of cardiomyocyte apoptosis，promote anti-apoptotic protein BCL-2 and inhibit the expression of pro-apoptotic protein BAX; inhibit the expression of autophagy-related proteins LC3 and Beclin-1，which were significantly different compared with the model group（P<0.05）.Conclusion：Simiao Yongan Decoction can improve coronary heart disease with phlegm and blood stasis syndrome rats′ blood lipids and coagulation，as well as endothelial dysfunction.Moreover the mechanism may probably be related with suppression autophagy-related apoptosis.
Keywords Simiao Yongan Decoction; Coronary heart disease; Phlegm and blood stasis syndrome; Rat model; Myocardial injury; Protective effects; Autophagy; Apoptosis
中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.07.011
冠心病仍是全球范围内第一位致死、致残原因，占全球总死亡人数的30%。本病相当于中医的“胸痹”“心痛”，为本虚标实之证。气血阴阳亏虚为本，痰浊、瘀血、气滞、寒凝为标。西医学认为动脉粥样硬化及心肌缺血是冠心病主要的病理特征，动脉粥样硬化主要由脂代谢紊乱引起，为中医学“痰”的表现，心肌缺血导致血流运行缓慢，为中医学“瘀”的表现，越来越多的研究表明冠心病痰瘀互结证是目前冠心病较常见且病变程度较严重的证型[1-5]。
痰瘀同治法是目前治疗冠心病痰瘀互结证的常用方法，但其临床疗效评价尚待进一步明确[6]。陈可冀院士等认为痰瘀日久，因瘀致毒，痰、瘀、毒互结为冠心病病情发展与恶化的关键所在[7]，在治疗中注重“化毒”。四妙勇安汤是治疗热毒炽盛之脱疽的经典名方，亦是治疗冠心病热毒血瘀证的临床常用方剂[8-9]。方中金银花为君药，甘寒入心，清热解毒生津;玄参咸寒，滋阴降火、软坚散结，当归辛苦温，苦能燥湿、辛够通，二药共为臣药;连翘清热解毒、散结消肿，为佐药;甘草甘温，缓急和中、止痛散寒，为使药。全方以“清热解毒、活血止痛”为治疗要点。本研究以四妙勇安汤治疗冠心病痰瘀互结证，突破以往冠心病痰瘀互结证的“痰瘀同治”法，以期为冠心病痰瘀互结证提供新的理法方药。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 健康无特定病原体（SPF）级SD大鼠150只，雄性，8～10周龄，体质量（80±20）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2016-0006，适应性喂养1周。中国中医科学院中医基础理论研究所伦理委员会审批（伦理审批号：2018-095）。
1.1.2 药物 中药饮片（金银花、玄参、当归、连翘、甘草）购自北京同仁堂药店。
1.1.3 试剂与仪器 TUNEL试剂盒（Promaga Corporation，美国，货号：0000382112）;Beclin-1兔多克隆抗体（Cell Signal，美国，货号：3738）、LC3 A/B兔多克隆抗体（Cell Signal，美国，货号：4108）、Bax兔多克隆抗体（Cell Signal，美国，货号：2772），GAPDH兔单克隆抗体（Cell Signal，美国，货号：5174）;BCL-2兔多克隆抗体（Abcam，美国，货号：ab196495）;增强化学发光（ECL）试剂盒（Thermo，美国，货号：TK273732）;辣根过氧化酶标记山羊抗兔IgG（Santa Cruz，美国，货号：sc-2357）;小动物呼吸机（上海嘉鹏科技有限公司，型号：DW2000）;多道生理信号采集处理系统（成都仪器厂，型号：RM6240BD）。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 造模组大鼠随机分为模型组（冠心病痰瘀互结证组）和四妙勇安汤低、中、高剂量组，分别给予药物或者同等体积生理盐水灌胃，1次/d，连续8周。正常对照组大鼠给予普通饲料喂养;根据相关报道方法[10]，造模组大鼠在高脂喂养4周后，选择血脂升高的大鼠行冠脉结扎，术前禁食不禁水12 h，以2%戊巴比妥钠（2.3 mL/kg）腹腔注射麻醉后固定于鼠台，气管插管，微型动物呼吸机支持呼吸，频率50～60次/min，潮气量4～6 mL。胸骨正中切口，钝性分离皮下组织及肌肉，在胸骨左缘3、4肋间开胸暴露心脏。打开心包膜，揭开脂肪垫，暴露左心耳后，持7号针线，在肺动脉圆锥和左心耳之间冠状动脉左前降支（Left Anterior Descending Coronary，LAD）處穿一缝合线并结扎。
1.2.2 给药方法 1）正常对照组：大鼠正常喂养至实验结束。2）模型组（冠心病痰瘀互结证组）：给予药物同体积生理盐水灌胃2周，大鼠开胸后结扎冠状动脉左前降支致心肌缺血，继续给予与药物同体积生理盐水灌胃6周至实验结束。3）四妙勇安汤高剂量组：四妙勇安汤（当归90 g、金银花90 g、玄参60 g、甘草30 g，浓缩成2 g/mL的生药煎剂），给予28 g/（kg·d）药物灌胃，2周后，大鼠开胸结扎冠状动脉左前降支致心肌缺血，继续给予中药灌胃6周至实验结束。4）四妙勇安汤中剂量组：给予14 g/（kg·d）药物灌胃，2周后，大鼠开胸结扎冠状动脉左前降支致心肌缺血，继续给予中药灌胃6周至实验结束。5）四妙勇安汤低剂量组：给予7 g/（kg·d）药物灌胃，2周后，大鼠开胸结扎冠状动脉左前降支致心肌缺血，继续给予中药灌胃6周至实验结束。
1.2.3 检测指标与方法 1）血清三项及凝血三项：血清三项包括总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL）;凝血三项包括血浆活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）、纤维蛋白原（Fib）。实验结束前，大鼠禁食不禁水12 h，2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，经腹主动脉取血液约5 mL，离心半径13.5 cm，1 000 r/min离心10 min，收集血清，液氮速冻，-80 ℃保存。以全自动生化分析仪测定血清TC、TG及LDL含量;收集血浆，以全自动凝血分析仪检测血浆APTT、PT及Fib。2）血清炎症介质白细胞介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）测定：大鼠禁食不禁水12 h，3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，经腹主动脉取血液约5 mL，离心半径13.5 cm，1 000 r/min离心10 min，收集血清，液氮速冻，-80 ℃保存。按Elisa试剂盒说明检测血清IL-8、TNF-α含量。3）血清内皮素（ET-1）、可溶性血管细胞黏附分子（sVCAM-1）测定：大鼠禁食不禁水12 h，3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，经腹主动脉取血液约5 mL，离心半径13.5 cm，1 000 r/min离心10 min，收集血清，液氮速冻，-80 ℃保存。按Elisa试剂盒说明检测血清ET-1、sVCAM-1含量。4）TUNEL法检测大鼠心肌细胞凋亡：实验结束后，用3%戊巴比妥钠麻醉，开胸腔，取出心脏，将缺血区心肌组织（左心室前壁中间段）剪下，常规石蜡包埋，制备3 μm切片。按照试剂盒说明进行组织切片细胞凋亡检测，共聚焦显微镜下观察。正常心肌细胞核呈蓝色，凋亡细胞核呈深浅不一的绿色。每张切片于凋亡细胞分布区域随机取5个高倍视野，计算平均每个视野中的凋亡细胞数占总细胞数的百分比（%），以凋亡指数（Apoptotic Index，AI）表示。5）大鼠心肌组织凋亡及自噬相关蛋白表达测定：实验结束后，开胸腔，取心尖组织50 mg左右，提取心肌组织总蛋白，用于Western blotting检测，分别检测自噬相关蛋白LC3 A/B，Beclin-1;凋亡相关蛋白Bcl-2，Bax，4 ℃过夜孵育，1×TBS-T洗膜后，室温下以相应的Ⅱ抗孵育1.5 h，并以GAPDH单克隆抗体重复上述实验过程，作为上样对照。
1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料均采用均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析进行多组间比较，采用q检验进行多组间两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 四妙勇安汤对冠心病痰瘀互结证大鼠血脂的影响 模型组大鼠血清TC、TG及LDL含量较正常对照组均显著升高，其中TC为正常对照组的1.4倍（P<0.05），TG为正常对照组的1.7倍（P<0.05），LDL为正常对照组的1.3倍（P<0.05）;四妙勇安汤干预后可不同程度降低模型组大鼠血清TC、TG及LDL含量，其中以四妙勇安汤小剂量组TC含量较模型组低15%（P<0.05），TG含量较模型组低35%（P<0.05），LDL较模型组低3%（P<0.05）。见图1。
2.2 四妙勇安汤对冠心病痰瘀互结证大鼠凝血功能的影响 模型组APTT、PT较正常对照组显著缩短，Fib含量较正常对照组显著升高，其中APTT较正常对照组缩短10%（P<0.05），PT时间较正常对照组缩短2%（P<0.05），Fib含量较正常对照组升高17%（P<0.05）;四妙勇安汤干预后显著增加了APTT，与模型组比较，大剂量组增加了10%（P<0.05），中剂量组增加了18%（P<0.05）。见图2。
2.3 四妙勇安汤对冠心病痰瘀互结证大鼠血清TNF-α、IL-8的影响 模型组TNF-α、IL-8含量较正常对照组均显著升高，其中TNF-α为正常对照组的1.11倍（P<0.05），IL-8为正常对照组的1.1倍（P<0.05）;四妙勇安汤干预后可不同程度降低模型组大鼠血清TNF-α及IL-8含量，其中四妙勇安汤中剂量及小剂量组中血清TNF-α分别较模型组降低9%与14%（P均<0.05）;四妙勇安汤中剂量组中血清IL-8较模型组降低7%（P<0.05）。见图3。
2.4 四妙勇安汤对冠心病痰瘀互结证大鼠血清sVCAM-1、ET-1的影响 模型组大鼠血清sVCAM-1、ET-1含量较正常对照组均显著升高，其中sVCAM-1为正常对照组的1.06倍（P<0.05），ET-1为正常对照组的1.09倍（P<0.05）;四妙勇安汤干预后可不同程度降低模型组大鼠血清sVCAM-1及ET-1含量，其中四妙勇安汤中剂量及小剂量组中血清sVCAM-1分别较模型组降低5%与7%（P<0.05）;四妙勇安汤小剂量组中血清ET-1较模型组降低12%（P<0.05）。见图4。
2.5 四妙勇安汤对冠心病痰瘀互结证大鼠心肌细胞凋亡的影响 与正常对照组比较，模型组非梗死区心肌TUNEL阳性率升高20倍（P<0.05）。四妙勇安汤干预后可不同程度降低模型组大鼠心肌TUNEL阳性率，其中四妙勇安汤中剂量及小剂量组TUNEL阳性率分别较模型组降低60%与80%（P<0.05）。见图5。
2.6 四妙勇安汤对冠心病痰瘀互结证大鼠心肌凋亡相关因子Bcl-2、Bax蛋白表达的影响 与正常对照组比较，模型组Bcl-2蛋白表达降低46.3%（P<0.05），Bax蛋白表达是正常对照组的2.28倍（P<0.05）。四妙勇安湯可显著诱导抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，与模型组比较，四妙勇安汤大、中、小剂量组Bcl-2蛋白表达分别增加32.9%、36.7%及63.3%（P<0.05）;抑制促凋亡蛋白Bax的表达，四妙勇安汤大、中、小剂量组Bax表达分别降低37%、39.7%及52.1%（P<0.05）。见图6。
2.7 四妙勇安汤对冠心病痰瘀互结证大鼠心肌自噬相关因子Beclin-1、LC3 A/B蛋白表达的影响 ? 与正常对照组比较，模型组Beclin-1和LC3 A/B蛋白表达分别升高49%和73%（P<0.05）。四妙勇安汤干预后可不同程度降低模型组大鼠Beclin-1和LC3 A/B蛋白表达，与模型组Beclin-1蛋白表达比较，四妙勇安汤大剂量、中剂量与小剂量组分别降低了28%、34%和37%（P<0.05）;与模型组LC3 A/B蛋白表达比较，四妙勇安汤大剂量及中剂量组分别降低了21%和26%（P<0.05）。见图7。
3 讨论
随着现代人们饮食结构及生活方式的改变，冠心病痰瘀互结证已成为目前冠心病较常见的证型。本病的发生因饮食不节，过食肥甘，损伤脾胃，内生痰浊，痰浊阻滞，滞而成瘀，痰瘀互结，壅阻心脉。或因正气亏虚，气虚血瘀，痹阻胸中，胸阳不振，痰浊内生，痰瘀痹阻心脉。由此可见，痰可致瘀，瘀能化痰，痰瘀日久生毒，循环反复。本实验采用高脂饲料喂养造成脂代谢紊乱，模拟“痰”的特征，冠状动脉左前降支结扎造成心肌缺血，模拟“瘀”的特征，二者联合建立冠心病痰瘀互结证大鼠模型，使造模结果接近于临床CHD痰瘀互结证的病机特点。以原方剂量为大剂量组、1/2原方剂量为中剂量组、1/3原方剂量为小剂量组，各给药8周，通过血清学检测证实模型组大鼠TC、TG及LDL均升高;与模型组比较，各剂量中药组均不同程度降低了血脂含量，说明四妙勇安汤可以改善痰瘀互结证血脂情况。凝血三项间接可反映血凝（血瘀）状态，文献研究表明冠心病痰瘀互结证血浆PT和APTT降低、FIB升高，则提示血液处于高凝状态，血流速度减慢[11]，其中APTT是对内源性凝血系统较敏感的指标。本研究证实中药组可以显著延长冠心病痰瘀互结证大鼠血浆APTT时间，提示四妙勇安汤对冠心病痰瘀互结证具有一定抗凝作用。作为重要的炎症介质，TNF-α参与血管舒张与水肿形成、促进炎症部位的氧化应激。IL-8是一种趋化因子，可与其特异性受体结合，亦是一种重要炎症介质，IL-8、TNF-α过度表达提示炎症介质失衡。本研究显示，模型组增加了炎症介质表达，与相关报道一致[12]。中药组可显著降低血清TNF-α、IL-8含量，提示四妙勇安汤对冠心病痰瘀互结证具有一定抗炎作用。现代研究证实，痰瘀互结证与内皮细胞损伤密切相关，其分泌的ET-1、sICAM-1等血管活性物质可能是冠心病“血瘀”病理重要标志物[13]。本研究显示中药组可显著降低模型组大鼠sICAM-1、ET-1的表达，提示四妙勇安汤可以改善冠心病痰瘀互结证大鼠血管内皮损伤。
细胞凋亡是细胞在基因控制下自我消亡的一种生物现象，在动脉硬化形成过程中，不规则的细胞凋亡引起动脉管壁在形态、结构及代谢等方面的异常[14]。心肌细胞凋亡是冠心病心功能减弱的生物学基础之一，是影响冠心病痰瘀互结证转归、预后的关键。痰瘀互结日久，加重心肌缺血及损伤，诱发心肌细胞凋亡、坏死，痰瘀互结与细胞凋亡具有一定的内在联系[15]，抗凋亡治疗在减少缺血损伤方面具有重要意义。TUNEL法是结合了形态学和分子生物学的一种检测细胞凋亡的常用方法，既可定性又可定量，可准确定位，且灵敏度高，能准确地反映细胞在凋亡时的形态学和生物学特点[16]。抗凋亡基因Bcl-2与促凋亡基因Bax参与心肌细胞凋亡的调控，抑制细胞凋亡的发生和发展，是促进心肌损伤后心功能恢复和减轻心肌致死性损伤的一条重要途径[17]。TUNEL检测细胞凋亡发现，中药组可显著降低模型组大鼠心肌细胞凋亡率。本研究采用Western blotting检测凋亡相关因子Bcl-2、Bax的蛋白表达，亦发现中药组可明显降低模型组大鼠Bax蛋白表达，增加Bcl-2蛋白表达。以上均提示四妙勇安汤可通过调节凋亡相关因子的表达，抑制冠心病痰瘀互结证大鼠心肌细胞凋亡，减轻心肌损伤。进一步研究发现其抑制心肌细胞凋亡的机制可能与自噬相关。
自噬是细胞的自我吞噬、降解的过程，对维持细胞内稳态起关键作用。自噬是一种细胞内防御和应激调控机制，也是参与心肌缺血损伤的重要机制之一，缺血初期，适度的自噬通过处理损伤的细胞器，为细胞成活的关键代谢过程提供营养物质，对心肌细胞具有保护作用。严重或长时间缺血时，高水平自噬激活可通过炎症反应等引起心肌细胞凋亡[18-19]。酵母Atg6同源蛋白B细胞淋巴瘤蛋白质-2-相互作用蛋白质-1（B-cell lymPhoma-2-interacting protein-1，Beclin1）是第一个被发现的哺乳动物自噬相关基因，微管相关蛋白1轻链3（Microtubule-associated Protein 1 Light Chain 3，LC3）是第一个被发现的自噬体标记蛋白，二者是反映细胞自噬的重要指标[20]。Beclin1是自噬小体形成以及自噬进程中的一个关键的蛋白调节因子，能与多种蛋白质，其中Beclin1-Bcl-2是自噬与凋亡间第一个确定的分子连接;另一方面，过度激活的自噬引起Beclin1表达水平升高，释放促凋亡蛋白BAK/BAX，从而促进细胞凋亡，加重损伤[21-22]。自噬充分体现了机体的自我修复与清除之间的平衡。已有研究证实中药可通过干预心肌细胞自噬发挥保护心肌的作用[23-27]。本研究采用Western blotting，检测自噬相关因子Beclin-1及LC3A/B的蛋白表达，发现模型组Beclin-1、LC3A/B蛋白表达较正常对照组均显著升高，发现中药组可明显降低Beclin-1，LC3A/B的蛋白表达，提示四妙勇安汤对自噬有一定抑制作用。
综上所述，四妙勇安汤可通过改善冠心病痰瘀互结证大鼠血脂、血凝、内皮功能及抑制心肌细胞凋亡等作用，保护受损心肌，其机制可能与抑制心肌缺血引起的自噬有关，但仍需进一步探索。
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（2020-05-05收稿 责任编辑：芮莉莉）
