泡菜中高产乳酸功能性乳酸菌的筛选

    冯伟 冯雅琪 徐晶雪

    

    

    

    摘 要：乳酸菌是生物体中有益菌的重要组成，筛选出产酸能力强、能够起到肠道医生作用且安全性高的乳酸菌，并应用于相关发酵产品生产对生物健康至关重要。该研究通过碳酸钙-MRS透明圈法从酸菜中筛选乳酸菌，利用对羟基联苯法测定乳酸菌发酵液中乳酸含量，选取产乳酸超过30mg/mL的菌株4株作为候选菌株，对其进行常见致病菌的抑菌能力和十大类常见抗生素的药物耐受性的测定。结果表明，备选菌株对常见致病菌均具有一定的抑菌性能，其中2个菌株在抗生素耐药性方面表现出了较好的安全性。筛选出的2株菌株的产酸性能强，肠道有害菌抑菌效果明显，安全性高。

    关键词：乳酸菌;乳酸;抑菌;耐药

    中图分类号 TS255.54文献标识码 A文章编号 1007-7731（2021）07-0032-03

    Screening of Functional Lactic Acid Bacteria with High Lactic Acid Production in Kimchi

    FANG Wei1 et al.

    （1Daqing Normal University， Daqing 163712， China）

    Abstract： Lactic acid bacteria are an important component of beneficial bacteria in organisms. It is very important for biological health to screen the lactic acid bacteria with strong acid production ability， which can play the role of intestinal doctor and have high safety and apply them to the production of related fermentation products. This experiment through the calcium carbonate-MRS transparent ring method from the screening of lactobacillus in the sour pickled cabbage， using the method of hydroxy diphenyl lactic acid content in the determination of lactic acid bacteria fermented liquid， and choose to produce lactic acid more than 30mg/mL strains 4 strains as candidate strain， on the strains of common pathogenic bacteria of ten kinds of common antibiotics antibacterial ability and the determination of drug tolerance. The results showed that all the candidate strains had certain antibacterial properties against common pathogenic bacteria， and two strains showed good safety in antibiotic resistance. Finally， two strains were obtained， which had strong acid production ability， obvious inhibitory effect on intestinal harmful bacteria and high safety.

    Key words： Lactobacillus; Lactate; Antibacterial; Drug resistance

    1 引言

    隨着经济的飞速发展，人们更加注重健康养生。乳酸菌是人体肠道有益菌群中的重要组成部分，近年来，随着人们对乳酸菌功能和作用机理的深入研究，乳酸菌被认为是最具有开发价值的健康菌，越来越受到关注。筛选出品质和性状更为优异的菌种对于乳酸菌产品的研发尤为重要。

    生物肠道有益菌中乳酸菌数量多，可通过菌体自身和产生的代谢物抑制致病菌从而调节肠道菌群平衡。乳酸菌在生物肠道内可以利用其中的营养物质代谢产生大量乳酸，乳酸使肠道酸性环境加强，许多致病菌因不能耐受酸性环境而死亡，也能通过产生酶阻止致病菌及其毒素黏附和侵入肠黏膜上皮细胞。保持肠道内的酸性环境，可促进肠蠕动，防止有害微生物的攻击，使机体保持健康，也可以增强肠道的免疫能力[1]。

    近年来的研究发现，乳酸菌中的耐药基因可能会通过多种方式转移给肠道中其他菌种，若转移到致病菌中，引起有害菌产生耐药性的危险。因此，根据国家药典规定益生菌需进行常见抗生素类药物耐药性测定，获得安全性乳酸菌至关重要[2]。

    本研究在传统发酵方法制作的泡菜中通过碳酸钙法筛选乳酸菌，进一步利用对羟基联苯法对菌株的产乳酸能力进行测定，选取产乳酸多的菌株作为候选菌株。采用杯碟法和药敏制片法对候选菌株分别进行抑菌性和耐药性的测定，以筛选出能够应用于发酵生产的安全性乳酸菌。

    2 研究方法

    2.1 试剂的配制 （1）MRS培养基（1000mL）[3]：K2HPO4 2.0g、柠檬酸三铵2.0g、无水乙酸钠5.0g、MnSO4·7H20 0.25g、MgSO4·7H2O 0.58g、葡萄糖20.0g、蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母浸膏5.0g、吐温-80 1mL。

    （2）碳酸钙-MRS培养基：MRS培养基中加琼脂20.0g在灭菌后加入5%（W/V）灭菌CaCO3粉末摇匀，制备具有CaCO3的MRS培养基。

    （3）钨酸溶液[4]：0.667mol/L硫酸及10%（W/V）钨酸钠溶液等体积混合，使用前配制。

    （4）20%（W/V）硫酸铜溶液：称取硫酸铜20g，加蒸馏水定容至100mL。

    （5）对羟基联苯溶液：称取对羟基联苯1.5g溶于100mL的0.125mol/L氢氧化钠溶液中（配制时加热助溶，溶解后为澄清液体），贮存于棕色瓶中，保存于4℃冰箱。

    （6）乳酸标准储存液（0.5mg/mL）：精确称取无水乳酸锂53.25mg，溶于50mL蒸馏水中，加0.5mol/L硫酸10mL，后加蒸馏水定容至100mL，混匀后保存于4℃冰箱。

    2.2 乳酸菌筛选 取适量样品于9mL生理盐水中，进行适当稀释后涂布后涂布于碳酸钙-MRS培养平板中，37℃培养箱中倒置培养48h。将有明显透明圈单菌落采用平板划线分离法进行划线分离，直至得到纯菌。对比菌落形态并采用革兰氏染色进行初步形态鉴定。

    2.3 菌株的产乳酸能力测定

    2.3.1 标准曲线制作 0.5mg/mL乳酸标准液与发酵液同样预处理后，取0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60mL处理液，分别加进预先编号的试管，再用蒸馏水补足体积至5mL，氢氧化钙0.05g，20%硫酸铜0.8mL，浓硫酸6mL，对羟基联苯0.125mL，静置15min，加热显色5min。分别测定565nm吸光度[4]。

    2.3.2 发酵液中乳酸含量测定 将筛选得到的乳酸菌菌株接种至接种至MRS液体培养基中，重复转接3次。菌悬液离心，吸取上清液0.5mL置于洁净离心管中，加入等体积1mol/L硫酸，静置，10000r/min离心10min，以除去硫酸钙，取上清液适当稀释，吸取稀释液2mL于洁净离心管中，加入2mL钨酸溶液，混匀，室温静置，直至溶液中出现明显絮状物，10000r/min离心10min，取上清液置于10mL洁净离心管中，60℃水浴保温30min左右，依据标准曲线中乳酸测定方法进行测定。

    2.4 菌株抑菌能力测定 （1）指示菌菌悬液和实验菌株菌液的制备：将实验室保藏的大肠杆菌等致病菌作为指示菌，指示菌液体培养基以5%的接种量转接3代，实验菌株以1%接种量转接3次。（2）检测平板的制作：向培养皿中倒入10mL 2%水琼脂培养基，冷却放入牛津杯，将适当稀释度指示菌液0.5mL与另10mL营养琼脂混合均匀倒入平板，冷却即为检测平板。（3）菌株抑菌能力的测定：将实验菌菌悬液4000r/min离心5min，取适量上清液加入到检测平板小孔中，每个样品做3个对照，待一定时间后观察乳酸菌培养液对常见致病菌抑菌圈直径[5]。

    2.5 菌株耐药能力测定 向培养皿中倒入10mL2%水琼脂，将另10mL灭菌MRS培养基与适量实验菌株菌悬液混合，倒入平皿。待冷却把各抗生素药敏制片贴在平板上。37℃培养48h，测量各抗生素抑菌圈直径。

    3 结果与分析

    3.1 乳酸菌的初步筛选与形态鉴定 通过碳酸钙透明圈法筛选得到10株有透明圈菌株，透明圈直径差距不大，详见表1。

    选择产生透明圈的菌株10株进行革兰氏染色，染色结果均为革兰氏阳性，结合各菌株菌落形态白色较小不透明的特点，初步判断均为乳酸菌，详见表2。

    3.2 菌株的产乳酸能力

    3.2.1 乳酸标准曲线 经试验测定乳酸含量的标准曲线为：y=0.117x+0.0122，R2=0.9937

    3.2.2 菌株的产乳酸量 采用对羟基联苯法测定菌株产乳酸量，结果如表3所示。其中，Z2、Z3、Z6和Z7菌株产乳酸能力较高，超过30μg/mL，作为备选菌株。

    3.3 菌株的抑菌性能 选择产乳酸能力高的4株菌进行抑菌试验，主要观察其对肠道内常见菌株大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌性能，结果如表4所示。由表4可知，4株菌对于3种常见致病菌都有一定程度的抑菌作用。其中，Z3、Z6号菌株对大肠杆菌的抑制作用较明显，相比较，Z6号菌株对3种常见致病菌的抑制作用比Z3号菌株强。

    3.4 菌株的耐药性能 主要测定Z2、Z3、Z6、和Z7号菌株对常用八大类抗生素的耐药性能，通过实验可知菌株对抗生素类药的物敏感性，其结果如表5所示。由表5可知，Z2菌株对青霉素类、四环素类、糖肽类具有耐药性;Z7菌株对青霉素类、大环内酯类、喹诺酮类具有耐药性，对糖肽类中度耐药;Z3对四环素类具有耐药性、糖肽类中度耐药;Z6仅对糖肽类中度耐药。综合比较菌株Z3与Z6的耐药类型较少，安全性较高。

    4 结论

    本研究通过碳酸钙-MRS透明圈法初步筛选得到具有产透明圈能力的菌株10株，通过菌落形态观察和革兰氏染色初步判断各菌株为乳酸菌，进一步测定菌株产乳酸能力，得到4株产乳酸量超过30mg/mL乳酸菌。4株菌对于肠道中常见有害菌均具有一定的抑制性，抑制性与产乳酸量有一定相关性，产酸量较高的Z3和Z6对有害菌的抑制性也较明显。经抗生素耐药性试验表明，Z3和Z6这2株菌表现出了较好的安全性。最终筛选得到2株具有产酸性能强、肠道有害菌抑菌效果明显且安全性高的菌株，可作为乳酸菌制剂或发酵食品添加剂的备选菌株。

    参考文献

    [1]刘小翠，安志鹏，杨莹，等.小米发酵液中高发酵性能乳酸菌的分離筛选与鉴定[J].食品科技，2020，45（08）：15-19.

    [2]孙悦.抗耐药性埃希氏大肠杆菌乳酸菌的筛选及抑菌机制研究[D].锦州：渤海大学，2020.

    [3]袁丹丹，张晓元，郝荣华，等.产抑菌物质乳酸菌的筛选鉴定及生物学特性研究[J].生物技术，2019，29（04）：376-381.

    [4]刘树昕，吴爱娟，甄妮，等.广谱抑菌乳酸菌的筛选及其细菌素相关基因分析[J].食品科学，2020，41（06）：101-107.

    [5]高熳熳，焦新雅，张志胜，等.侗族传统发酵酸肉中乳酸菌的筛选、发酵特性及安全性分析[J].食品工业科技，2020，41（12）：94-99，105.

    （责编：张宏民）