全唾液法分析糖尿病及牙周炎伴牙列缺损患者行种植义齿修复的临床效果
周琦琪 韩祥祯 张文静 崔杰
[摘要]目的：探究糖尿病及牙周炎伴牙列缺損患者种植治疗的预后疗效，以此作为该类患者种植治疗术前评估，为提高种植成功率提供参考依据。方法：分别于种植前和种植后4周、12周与24周收集2型糖尿病患者组、牙周炎患者组以及对照组患者唾液，记录探诊深度、测量种植体稳定性，实验ELISA法检测唾液中的IL-1β与TNF-α，荧光定量PCR测量TF、Pg、Td、Fn的相对SQ值变化。结果：2型糖尿病患者组、牙周炎患者组的ISQ值与对照组比较无统计学差异（P<0.05），组内显示对比ISQ值在12周时明显高于术中，提示稳定性呈增加趋势，具有统计学意义（P<0.05）;两实验组的唾液中IL-1β和TNF-α的含量高于对照组，并有统计学意义（P<0.05），且两组随时间推移，唾液中IL-1β和TNF-α的含量均降低，具有统计学意义（P<0.05）;Tf、Pg、Fn 的相对SQ值四次检查结果逐渐减少，差异有统计学意义（P0.05）。结论：菌斑控制良好的牙周炎患者与血糖控制良好的糖尿病患者，均可取得与正常患者一致的种植初期稳定性，且炎性因子和细菌水平持续降低，提示两者均可以取得较好的种植预后效果。
[关键词]全唾液;糖尿病;慢性牙周炎;种植术;种植体稳定性
[中图分类号]R782.12? ? [文献标志码]A? ? [文章编号]1008-6455（2021）01-0104-05
Analysis of the Clinical Effect of Complete Saliva Analysis on the Repair of Dental Implant Denture in Patients with Diabetes and Periodontitis with Dentition Defect
ZHOU Qi-qi， HAN Xiang-zhen， ZHANG Wen-jing， CUI Jie
（Department of Prosthodontics， the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830054， Xinjiang， China）
Abstract： Objective? To explore the prognosis of patients with diabetes and periodontitis with dentition defect，and to provide reference for improving the success rate of implantation. Methods? Saliva of patients with type 2 diabetes mellitus， periodontitis and control group were collected before implantation and 4 weeks， 12 weeks and 24 weeks after implantation， respectively. The depth of exploration was recorded and the stability of implantation was measured. IL-1B and TNF-α in saliva were detected by experimental ELISA， and the changes of TF，Pg，Td，Fn were measured by RT-PCR. Results There was no significant difference in ISQ between the two groups （P<0.05）. The results showed that the ISQ of the two groups was significantly higher than that of the control group at 12 weeks， suggesting that the stability was increasing （P<0.05）. The contents of IL-1β and TNF -α in saliva of the two experimental groups were higher than that of the control group （P<0.05）， and the two groups were statistically significant （P<0.05） .The contents of IL-1β and TNF-α in saliva were all decreased （P<0.05）.The relative SQ values of TF， PG and FN were gradually decreased （P<0.05）， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion? In a short period of time， periodontitis patients with good plaque control and diabetes patients with good blood glucose control can achieve the same implant stability as normal patients， and the inflammatory inheritance and bacterial level are reduced， suggesting that they can achieve better implant prognosis.
Key words： whole unstimulated saliva;diabetes mellitus; chronic periodontitis; implantation;implant stability quotient
牙列缺损是常见的口腔疾病，该疾病患者主要集中在老年人中，而中老年患者随着年龄增加，患牙周病与2型糖尿病的风险也随之变大。牙列缺损会严重影响患者的美观以及咀嚼功能，甚至影响患者的心理健康，很大程度上降低了患者的生活质量[1]。现今，随着生活水平的日益提升及口腔修复学科的发展，口腔种植的技术也愈加成熟稳定，修复后具有对原口腔结构损伤小，术后咀嚼效率较高等优点被越来越多的接受，已成为公认的首选修复方式[2]。在我国，牙周炎导致牙齿缺失一直排在失牙原因的首位。调查显示[3]，我国成人拔牙总量的40%是由于牙周疾病导致的。牙周炎患者的种植需求量由此加大，但由于牙周炎会造成牙槽骨吸收，并且菌斑控制不稳定会导致感染及种植体周围炎，所以牙周炎患者的种植选择，在临床种植术中一直存在风险[4]。糖尿病是一种与自身免疫、遗传等有关的代谢紊乱疾病，被认为易引起牙周组织中炎症因子含量的升高，炎性因子作为免疫调节系统的重要因子，使糖尿病与牙周病互为高危因素，从而影响种植体的骨结合[5-6]。长时间以来，医师在选择为牙周炎及糖尿病患者实施种植治疗时，都相对谨慎。本文拟通过先进的全唾液检测法深入研究糖尿病患者血糖水平控制情况、牙周炎患者菌斑控制情况对牙周组织状况改变的影响，进而系统评价部分口腔菌群对糖尿病及牙周炎伴牙列缺损患者实施种植义齿修复牙列缺损的前、后对植体稳定性的影响，为糖尿病及牙周病的患者行种植义齿修复前的条件评估及术后的治疗随访提供参考依据。
1? 资料和方法
1.1 临床资料：选择2017年9月-2019年9月在新疆医科大学口腔修复科行种植义齿修复的患有糖尿病及牙周炎的牙列缺损患者，以及单纯的牙列缺损患者为研究对象。牙周病组：牙周病伴牙列缺损患者18例;糖尿病组：糖尿病伴牙列缺损患者18例;对照组：正常牙列缺损患者18例，一般情况与其他两组类似。
1.2 纳入标准：①糖尿病：按1999年WHO诊断标准，临床诊断2型糖尿病确诊1年以上，内科查体排除冠心病、脑血管病、糖尿病肾病及视网膜病变等系统性疾病，实验期间继续原有药物治疗;②牙周炎：诊断标准按1999年美国牙周病分类国际研讨会，探诊深度>5mm，位点百分比≤30%，或探诊深度>6mm，位点≤10%的牙周炎患者，诊断为轻度慢性牙周炎[7]。
1.3 排除标准：①无牙颌或拒绝牙科检查或不能配合完成数据采集者;②患者有夜磨牙、紧咬牙症状;③无需骨增量治疗;④无吸烟、酗酒等不良嗜好;⑤无异常咬合习惯。
1.4 实验材料：人白介素-1β、人肿瘤坏死因子-α ELISA试剂盒（武汉博士德），Prime ScriptTM RT Reagent Kit（Perfect Real Time）试剂盒、SYBR Premix Ex Taq（Perfect Real Time）试剂盒（中国TaKaRa公司）;ITI种植体（ITI，Straumann? AG，Waldenburg，Switzerland），Osstell共振频率分析仪（瑞典），Florida探针（佛罗里达探针公司，美国），移液器0.2μl-1000μl（Eppendorf，德国）;荧光定量PCR仪（Bio-Rad CFX96，美国）等。
1.5 实验方法
1.5.1 全唾液样本采集：所有研究对象分别在术前、术后4周、12周、24周收集非刺激性全唾液样本，采用Rhodus[8]改良法，三组患者均在轻轻漱口后保持张嘴，保持唾液流入无菌管，收集约2ml，所得样本立即13 000r/min离心20min，取上清200μl，检测细胞因子。
1.5.2 种植治疗及牙周检查：所有患者均在术前3d接受洁治，所有种植治疗均由相同的一名种植医师及一名助手医师完成，植体系均同意统一选择ITI的4.1mm×（8～12）mm。术后嘱患者口服抗生素3d。
种植术前及术后4周、12周、24周对患者进行牙周探诊（Probing depth，PD）检查，使用Florida探针，采用标准0.2N检查患者口腔中除第三磨牙外的所有天然牙位点，并记录。种植后，各组患者按时随访并分别在不同記录时点摄取CBCT影像，观察种植体在骨内结合情况。
1.5.3 Osstell共振频率分析：在种植体植入前以及植入后4周、12周、24周行Osstell共振频率分析，共振频率分析仪可将共振转换为种植体稳定系数值（Implant stability quotient，ISQ）。ISQ介于1到100之间，数值越大表示稳定性增高。
1.5.4 ELisa细胞因子检测：采用ELISA试剂盒检测样本唾液中的IL-1β以及TNF-α。室温下静止放置解冻唾液标本，13 000r/min离心10min，取上清液，按照试剂盒说明操作，绘制标准曲线，记录样本中相应细胞因子的浓度并计算IL-1β、TNF-α的质量浓度（μg /L）。
1.5.5 RT-PCR细菌检测：引物由上海生工合成，内参基因选择细菌通用引物，序列为：上游引物5-CGCTAGTAATCGTGGATCAGAATG-3，下游引物3-TGTGACGGGCGGTGTGTA-5，扩增片段长度69bp;其余待测基因片段参照文献[9]，牙龈卟啉单胞菌（Pg）：上游引物5-GGAATAACGGGCGATACGA-3，下游引物3 -CACCGCTGACTTACCGAACA-5，扩增片段长度155bp;福赛斯坦纳菌（Tf）：上游引物5-AGAGCCTGAACCGGCCAAGT-3，下游引物3-ACAGCCCCACCTACGCACC-5，扩增片段长度208bp;齿垢密螺旋体（Td）：上游引物5-TAATACCGAATGTGCTCATTTACAT-3，下游引物3-TCAAAGAAGCATTCCCTCTTCTTCTTA-5，扩增片段长度316bp;（具缩核杆菌）Fn：上游引物5-GGCCACAAGGGGACTGAGACA-3，下游引物3 -TTTAGCCGTCACTTCTTCTGTTGG-5，扩增片段长度161bp。凝胶回收制备DNA模板。荧光定量PCR 反应体系为25μl：Premix Ex Taq 12.5μl，cDNA 2μ，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，ddH2O 9.5μl;反应参数设置如下：预变性，95℃ 3min，然后按95℃10s，58℃30s，进行40个循环。重复三次，测定样本的熔融曲线，测定相对SQ值=全唾液样本的目的细菌基因SQ均值/样本的内参基因SQ均值。
1.6 统计学分析：采用SPSS 24.0统计软件进行。荧光定量PCR的结果为定量资料，经检验为正太分布后，采用重复测量的方差分析，检验水准α=0.05。三组的种植体初期稳定为定量资料，采用独立样本的t检验，检验水准α=0.05。
2? 结果
2.1 患者基本情况：本研究严格按照纳入排除标准，共纳入18例2伴型糖尿病患者，18例伴牙周病患者，18例单纯牙列缺损患者。各组患者分别在不同时点摄取CBCT影像，观察植体在骨内结合情况。牙周病伴牙列缺损组种植术后12周的CBCT结果见图1;糖尿病伴牙列缺损组种植术后12周的CBCT结果见图2;正常对照组种植术后12周的CBCT结果见图3。
2.2 牙周探诊深度及稳定性分析：使用Florida探针记录患者术前、术后4周、12周、术后24周的唇颊侧近中、唇侧中央、唇侧远中、舌腭侧近中、舌腭侧中央、舌腭侧远中6个位点的探诊深度，并使用Osstell共振频率分析仪在术后即刻、术后4周、术后12周时测定并记录种植体稳定系数值，结果见表1～2。
牙周病组稳定系数（ISQ）检查结果在后期逐渐增高，探诊深度（PD）降低，差异有统计学意义（P0.05）。糖尿病组和对照组的PD值也随时间推移降低，变化有统计学意义（P<0.05）。糖尿病组ISQ值在术后末期明显高于术后早期，并有统计学意义（P<0.05）。
2.3 ELisa细胞因子检测结果：测得人白介素1-β（IL-1β）与人肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的质量浓度（pg·μl-1），见表3。
各组IL-1β和TNF-α的含量均呈现出随时间推移递减的趋势，IL-1β和TNF-α的差异值有统计学意义（P<0.05）。但结果显示糖尿病组与牙周病组的IL-1β和TNF-α含量高于对照组，均有统计学意义（P<0.05，P=0.03）。
2.4 细菌RT-PCR检测结果：可得出齿垢密螺旋体（Td）相对SQ值四次检查结果间无显著性差异（P>0.05），福赛斯坦纳菌（Tf）、牙龈卟啉单胞菌（Pg）、具核梭杆菌（Fn）的相对SQ值结果逐渐减少（P<0.05），糖尿病组的牙龈卟啉单胞菌（Pg）和具核梭杆菌（Fn）相对SQ值要高于对照组（P<0.05）。糖尿病组中福赛斯坦纳菌（Tf）相对SQ值小于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05），见表4。
3? 讨论
唾液是人体分泌的一种混合液体，可以以非侵袭性的安全方式提供人DNA、RNA等多样复杂的生物学信息。唾液因其容易获得，在疾病的早期检测标本选择中具有优势：有研究发现，在唾液中可以找到龋齿、牙周炎以及恶性肿瘤等疾病的蛋白标记物[10-12]。近年来，越来越多的研究开始利用全唾液法对疾病及相关因子的關系进行研究，苏哲君等[13]在研究牙周病伴2型糖尿病患者全唾液中的IL-6表达时发现，该因子的表达水平与血糖控制水平呈正比;王侗飞等[14]在研究中筛选出13个差异蛋白质，可能作为牙周炎患者的唾液生物标记物。
良好的骨结合被认为是种植治疗的前提，早期种植体的骨结合情况更是直接决定种植术是否成功[15]。种植的成功与否不仅靠影像资料观察，更可以由种植体稳定性参数来判断。共振频率分析是一种测量种植体稳定性的新方法，操作简易，对患者无创，本研究使用Osstell共振频率分析仪来测量种植体早期稳定性，定量的数字化参数可以更直接客观反映出骨整合的程度以及种植体稳定性的差异。实验结果显示，牙周病组的共振频率由术后呈递增趋势，可见其稳定性逐渐增加。12周后无论是牙周病组还是糖尿病组，其ISQ数值均与对照组无明显差异，这一结果显示，糖尿病患者与牙周病患者在种植后，只要注意血糖控制及术后菌斑控制，均可获得与正常种植患者同样的术后稳定性。
IL-1β由巨噬细胞、树突状细胞产生，是介导炎症反应的一个重要细胞因子，具有诱导破骨细胞形成、引起骨吸收的生物活性因子之一。TNF-α由巨噬细胞和单核细胞产生，作为一种促炎性因子，可参与正常炎症反应及免疫反应，可以在慢性牙周炎的发展中发挥致炎作用。IL-1β和TNF-α常被作为牙周炎患者的差异因子，研究显示IL-1β和TNF-α在正常患者中较牙周炎患者中低[16-17]。白细胞介素-1β作为一种作用广泛的细胞因子，能够抑制牙周韧带成纤维细胞ALP的表达，在牙周病的发展中，削弱骨组织形成与愈合，证实IL-1β参与了牙周病的发生发展[18-19]。此外，张兰等[20]通过研究糖尿病伴牙周病患者龈沟液中IL-1β含量发现，糖尿病伴牙周病组龈沟液中IL-1β含量显著高于正常对照组，说明了高血糖是促使牙周病情加重的重要原因，提示了糖尿病患者重视牙周组织健康维护的重要性，这一研究结果也与本实验相同。TNF-α可以刺激破骨细胞产生活性，在炎症过程中起到骨组织破坏的反面作用，而血糖控制可能与糖尿病牙周炎患者的炎性细胞因子水平有关，胡赟等[21]也在对植体预后的研究中发现，TNF-α在种植体周围炎发生发展过程中也有明显的升高趋势。本实验结果发现慢性牙周炎患者，伴2型糖尿病患者在术前检测中和牙周健康者唾液中IL-1β、TNF-α存在差异，且含量明显高于对照组。但经过牙周治疗的轻中度慢性牙周炎患者，血糖得到控制的2型糖尿病患者与牙周健康者相比，种植体稳定性没有差异。说明即使炎症因子水平较正常高，但并不影响植体初期的骨结合，牙周炎患者的植体有和正常牙列缺失患者一样的稳定性。这也提示菌斑控制在种植术中的重要性可能多于炎性因子的致病性。此外结果还显示，血糖控制稳定的2型糖尿病患者在种植术后，口腔内炎性因子的含量相对偏高，但是种植体初期稳定性差异不明显，同样可以达到预期的种植疗效。因此，笔者认为血糖控制稳定的2型糖尿病患者能够行种植治疗。笔者也认为炎性因子在牙周病与2型糖尿病患者中的含量虽有差异，但种植术后效果良好的原因与患者合格的菌斑控制、血糖控制有较大关系，这也提示严格的随访制度在种植治疗中的重要性。
牙周微生物作为牙周炎症的始动因素已得到多方位的证实，已研究发现与牙周炎相关的牙周致病菌有数十种。其中Pg、Tf、Td、Fn与牙周炎症有着密切的关联[22]。因此，本研究在多种牙周致病菌中选择了Pg、Tf、Td和Fn进行荧光定量的检测。结果显示：三组患者在种植前以及术后各个采集时点，唾液中四种致病菌的含量呈下降趋势，甚至术后24周时唾液中致病菌的量低于术前，这提示术后维护对种植效果的作用。糖尿病组患者唾液中的厌氧菌含量较高，这提示高血糖为龈下的细菌提供了充足的营养，小血管基底膜增厚，减少了供血以及供氧，有利于Pg和Fn这一类厌氧菌生长。Td黏附性强且对供氧敏感，所以更多在厌氧环境生存，在没有深大牙周袋的口腔健康者中检出率较低[23]。糖尿病组的Tf含量略低于对照组，这与马丽[24]、方冬冬[25]等研究结果一致，提示高血糖浓度可以抑制Tf细菌在龈下的繁殖。
血糖控制良好的糖尿病患者及菌斑控制良好的牙周病患者，在接受种植治疗24周后，炎性因子和细菌量的含量都呈下降趋势，但结果与正常组对比，其初期稳定性没有明显差异，说明患者由于自身疾病原因导致的炎症因子水平的升高，并未影响植体的早期骨结合。但由于个体之间的差异，以及不同患者的自我维护，血糖控制不稳定的糖尿病患者，在选择种植术时仍相对正常患者存在较大风险，且种植体周围炎的预防也存在挑战。积极控制血糖及菌斑，能取得24周内良好的种植稳定性，但对于种植体的长期疗效，还需进一步跟踪随访。
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[收稿日期]2020-02-17
本文引用格式：周琦琪，韩祥祯，张文静，等.全唾液法分析糖尿病及牙周炎伴牙列缺损患者行种植义齿修复的临床效果[J].中国美容医学，2021，30（1）：104-108.
