| 标题 | 试论细菌内毒素检查法在药品检验中的应用价值 |
| 范文 | 王闫 摘 要：在药品检测中我们常用到的细菌内毒素检查法是一种非常方便、快速、灵敏度高、操作简单的检验方式，并且这种方式能够带来很好的社会和经济效益，在中、美、日、英等国家的药典中均有相关的记载，也是现代社会中最常用的细菌内毒素检查法之一。细菌内毒素检查的方法有两种：凝胶限量法和光度定量测定法。通过这两种方式我们可以在药品检验、制药工艺、临床医学等方面进行相关的探究。本文重点讲述的则是在药品检验方面进行的相关探究与研讨并对此作出相关的分析和解释。 关键词：细菌内毒素；药品检验；鲎试验法 1 鲎试验法的原理 细菌内毒素（英文是Endotoxin）是革兰阴性菌细胞壁个层上的特有的一种结构。而内毒素可以作为外源性致热源，激活中性粒细胞，并使中性粒细胞释放出一种为内源性热原质的物质，可以作用于人体的体温调节中枢进而引起人体发热。在静脉注射时所使用的药品中，所含有的细菌内毒素如果超过一定的浓度，就会使人体的体温升高发生热原反应，这就会对药品的安全性产生一定的质疑。1968年美国的两位科学家Levin和Bang研究出来的用鲎试验法来检查细菌内毒素的方法中可以看出鲎试剂中的鲎血细胞受到细菌内毒素的作用会发生一系列的凝集霉的反应，形成一些用肉眼就可以观察到的凝固蛋白凝胶。所以我们将通过这个原理用鲎试剂来进行检测，进而判断出供试品中的细菌内毒素的限量是否符合相关规定。 2 细菌内毒素检查法的具体试验过程 2.1 内毒素标准品的简单介绍 国家标准中的细菌内毒素是从大肠埃希菌中提出并进行精炼而得到的。一般会在标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品效价的时候使用。细菌内毒素的用量我们用内毒素的单位EU来表示，1EU和1个内毒素国际单位（IU）相当。每1ng的工作标准品效价不能够小于2EU，也不能大于50EU，并且我们的数据要具有一定的稳定性和均一性，不能任意波动。 2.2 实验的注意事项 实验前要先将手用肥皂清洗干净，然后再用纯度为75%的酒精消毒；在移液管取样的时候要做好防止气体混入到移液管当中的准备；反应的过程中为了防止凝胶破碎进而导致假阴性的结果所以我们要保持试管比较平稳的移动避免大幅度的震动；在灵敏度的重新检验和干扰试验的时候两组实验应该同时进行；整个试验应该在干净的环境当中进行，防止有其他的微生物对试验造成不必要的干扰。 2.3 进行实验之前的准备工作 先把实验玻璃器皿放在酪酸洗液或者其他的热原灭活剂或清洗剂中充分的浸泡，然后将洗液处理干净并用蒸馏水将玻璃皿冲洗三遍以上；再将玻璃皿放在250℃的干燥箱中干烤30分钟以上，以除去可能存在的其他外源性内毒素对试验产生的干扰。 2.4 对鲎试剂的灵敏度进行再次检验 根据鲎试剂灵敏度的标示值（A），将细菌内毒素的标准品和专门的专门的检查水利用旋涡混合器混合溶解15分钟，完成之后再逐级两倍稀释，并计算出鲎试剂灵敏度的测定值（AC）。对鲎试剂的灵敏度进行再次检验时要严格执行每批选择新的鲎试剂。除此之外我们还要将稀释倍数加大的试剂进行不干扰试验，排除其他干扰因素的影响。 2.5 实验的具体操作过程 取四个相同的试管，在每个试管中都加入0.1ml的鲎试剂和细菌内毒素检查用水0.1ml，是两种溶液相溶解。取其中的任意两只试管，并在试管中加入最大稀释倍数的供试品溶液0.1ml，并将这两只试管作为供试品试管。在从剩下的两只试管中取其中的任意一只加入2A内毒素工作标准品溶液0.1ml作为阳性对照管，在最后剩下的一只试管中加入细菌内毒素检查用水0.1ml作为阴性对照管。将试管混匀封口后放在（36-38）℃的水浴中保温1小时，然后取出慢慢倒转180°并对试管进行观察，如果试管内的凝胶附着在试管壁上没有明显的改变则记为阳性（+），如若不然则为阴性（-）。供试品两个试管都是阴性才符合规定。 3 细菌内毒素检查法在药用原料、注射制剂方面的探究与研讨 3.1 在化学药品方面的探究与研讨 《中国药典》中有用细菌内毒素检查法（BET法）检查热原的药品有73個品种的原料药及其注射剂共205个。并且在之前的部分相关报道中说可以用BET法检查化学原料药及注射制剂中的热原有卡铂原料药、五种氨基酸原药、三磷酸胰苷二钠注射液、注射用脱氧核糖核酸等四十余种。在临床医学中如果有氰化物、硝酸、亚硝酸盐中毒现象发生，同上会选择亚甲蓝注射液来解毒，他的细菌内毒素的含量是影响该药品质量的重要指标。相关研究人士用动态比浊法对亚甲蓝注射液和低分子量肝素钙注射液进行相关的测定，并将测定的结果与凝胶法得出的结果相对比，发现亚甲蓝注射液的浓度为0.125mg/ml时并没有产生太大的干扰，所得到的数据是10mg/ml的样品的细菌内毒素均<0.25EU/ml；低分子量肝素钙注射液稀释到12.5IU/ml时对试验没有任何的干扰作用，当对样品进行细菌内毒素含量的检查时，发现其含量均<0.01IU/ml，与凝胶法测的结果基本一致，所以就得出这两个品种可以用细菌内毒素检查法。 3.2 在中药试剂方面的探究与研讨 在当下的国家标准中，明确指出有四个化学药注射剂（含中药成分）规定用细菌内毒素检查法来代替PT法。有的文献指出，金叶败毒注射液、舒血宁注射液、灯盏花素注射液等近20个品种都是细菌内毒素检查法的中药注射剂的成分。有些有识之士认为可以在国家标准的基础上对紫杉醇注射液用细菌内毒素检查法在进行相关的测定，以确定紫杉醇注射液的内毒素L不干扰试验的浓度。经过试验证明现在国家标准中所确定的内毒素的含量L=0.4EU/ml不能改变，三批紫杉醇注射液的干扰试验0.075mg/ml是符合要求的。但是也有一部分有识之士认为可以通过半定量法去计算生脉注射液中细菌内毒素的含量，觉得该药品可以用细菌内毒素检查法去探究。 4 细菌内毒素检查法的应用 凝胶法最早是由美国药典在1980年进行相关论述，并把这个方法作为仲裁法在美国、欧洲、日本等多个国家进行药品的检验。在其后动态浊度法、显色基质法、电泳法、酶联免疫等都有了很快的发展，它的优势就在于降低了无关干扰并且检查的速度相对来说是比较快的。在不断发展的自动化现代社会，各个国家都开始使用仪器自动化检测并用仪器对实验数据做出相应的分析和总结。此外，细菌内毒素检验所用的试剂量和样品量的要求在不断地降低，所用的鲎试剂也是少之又少，并且有很好的灵敏度和抗干扰的能力。 5 总结 细菌内毒素检查法在我国药品检验中是一项非常重要的质控技术，许多国家也在此领域展开了新的探索，以前对热原检查没有做出相关要求的品种也在逐步开始使用细菌内毒素检查法进行检验，虽然我国在细菌内毒素检查法方面的成就还存在一定的缺陷也不是特别突出，但是我们国家也在不断地突破和创新，为我国的药品检验做出了巨大的贡献。 参考文献 [1]《中国药房》杂志2017年第28卷第1～36期总目录[J].中国药房，2017，28（36）：5185-5208. [2]祝清芬，魏霞.药品细菌内毒素检查法质量标准研究存在问题及对策[J].食品与药品，2017，19（04）：287-291. [3]田祥学.细菌内毒素检查法及其在药品检验中的应用[J].中国医药指南，2015，13（23）：278-279. |
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