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蛹虫草液体深层发酵过程代谢物的变化

范文

吴敬燚

摘要：將蛹虫草置于28℃下230rp/min摇床培养，发酵液用等体积的乙酸乙酯进行萃取，获得其粗提物，采用薄层层析法（TLC）对提取物进行初步的分离鉴定。

关键词：液体深层发酵;代谢产物

蛹虫草（Cordycepsmilitaris）又名北冬虫夏草，子囊菌亚门，麦角菌目，麦角菌科、虫草属，是寄生在鳞翅目和鞘翅目等昆虫蛹体上的真菌。蛹虫草的药用与保健价值和冬虫夏草相似，为我国特有的一类珍贵药用真菌，其主要成分虫草素等含量远高于野生冬虫夏草，而且比冬虫夏草更易人工栽培，因此被选为冬虫夏草的最佳替代品而进行大量的人工培育。其生长受到温度、光照、培养基条件的影响。对蛹虫草菌丝生长的环境因子进行研究，结果表明其适宜条件为生长温度为1～30℃，最适温度为20℃，茵丝生长的pH范围是4.5～11.0，最适pH为7.0，菌丝生长阶段不需要光照。

蛹虫草子实体的化学成分含有：麦角甾-4，6，8（14）一四烯-3一酮，柠檬甾二烯醇，二十四烷酸单甘油酯，麦角甾醇（4），麦角甾醇过氧化物，麦角甾-7，22一二烯-33，5，一三醇，虫草素，腺苷，N一（2-羟乙基）腺苷。

对蛹虫草次生代谢产物的变化规律报道还较少，其作为冬虫夏草的替代品，研究并发现其次生代谢产物的变化规律，有利于指导工业化的大生产，以满足市场的需求。

1 器材和方法

1.1 实验器材

1.1.1 材料

蛹虫草

1.1.2 仪器与设备

旋转蒸发器、冷却水循环装置、循环水式多用真空泵、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、摇床、生化培养箱、水浴锅、电子天平、高效薄层硅胶板

1.1.3 试剂

乙酸乙酯、无水硫酸钠、蛋白胨、无水葡萄糖、展层剂、碘试剂、15%硫酸乙醇溶液。

1.1.4 常用培养基

固体平板活化培养基：马铃薯200g/L.（去皮，切成小块煮沸20min，6层纱布过滤），葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，以水定容。

液体摇瓶培养基：马铃薯200g/L.（去皮，切成小块煮沸20min，6层纱布过滤），葡萄糖20g/L，+1%蛋白胨

1.2 实验方法

1.2.1 蛹虫草菌种活化

1）配制PDA培养基100ml;

2）置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，121℃、30min;

3）每平板倒20ml培养基，倒5个培养基;

4）超净工作台接入蛹虫草菌种;

5）平板置于生化培养箱中28℃活化，培养5-6天。

1.2.2 PDA液体培养基的配制

1）配制7.5LPDA培养基，加入1%蛋白胨，充分溶解后分装于50个250ml三角瓶中，液体培养时装液量为150ml/250ml;

2）置于高压蒸汽灭菌锅中121℃、30min灭菌;

1.2.3 接种、培养

1）为保证每瓶接入的菌种数量相等，于超净工作台上用已灭菌的胶头滴管钝端打孔;

2）用接种针往每瓶培养基接入一块菌种;

3）将已接如菌种的培养基放入摇床中培养，28℃，230rpm。

1.2.4 过滤、萃取

1）取空白对照，即接入菌种的当天做空白对照，之后每两天取三瓶培养基，用三层纱布将其分别过滤，并将菌体放入称量纸中放入烘箱中烘干;

2）发酵液装进经清洗烘干的棕色试剂瓶中用等量乙酸乙酯混合萃，静置2天，充分萃取。

1.2.5 旋转蒸发

1）经分液漏斗分液之后有机相用无水硫酸钠吸去残留的水相，过滤。

2）蒸干乙酸乙酯，称重。

1.2.6 层析

1）将萃取得到的物质用甲醇溶解，浓度为5mg/ml;

2）用毛细管吸取样品点到已活化的GF254高效薄层层析硅胶板上，点的直径在2～3mm，距薄层一端距离为1cm左右，各样品之间的距离一般也控制在1cm左右;

3）将薄层层析硅胶板放入已配制好的展层剂中，当展层剂上行到距离硅胶板另一端1cm处时，取出硅胶板，待溶剂挥发干后于紫外灯下观察结果;

4）将点过样品薄层板放入碘缸，进行碘染色;

5）显色：将点过样品的薄层板用镊子直接浸入 15%硫酸乙醇溶液中，取出吹干后放置电炉上小火慢慢烘烤到呈明显的斑点即可;

6）拍照并比较、分析。

2 结果与分析

2.1 结果

在28℃，230rpm摇床培养下，蛹虫草代谢产物的情况如下表1。

将上表按平均值与时间之间的关系制成曲线图：

次生代谢产物经薄层层析，显色后，图形如下：

从上图可以看出蛹虫草生长过程的代谢物经过薄层层析后在硅胶板上呈现出数量不同的条带，表明在其生长过程中其次生代谢产物的种类发生了变化。随着发酵天数的增加，其次生代谢产物种类呈现有规律的变化，且其重量也发生着变化，发酵到第十二天时其代谢产物种类最多，在硅胶板上呈现最多的条带;之后其在硅胶板上呈现的条带变化不明显，表明其代谢产物基本不发生变化。

2.2 分析

蛹虫草在其开始生长阶段1-2天中，其初生代谢产物不断增加，因其在适应期中细胞数没有增加，但细胞内的合成代谢十分活跃，表现为代谢产物总量不断增加;接着细胞利用其数量较多的初生代谢产物合成次生代谢产物，表现为代谢产物的总量下降，而代谢产物的种类上升;当菌体生长到一定阶段，其代谢产物的种类达到最多（第12天）;随后菌体产生一些新的代谢产物，而其总量却下降了。

在蛹虫草不断生长的过程中其生长的环境不断发生变化，由于培养基的内营养物质浓度的下降、通气量的不足等原因使得蛹虫草代谢产物的合成与分泌受到影响。

本实验探究了蛹虫草生长过程其代谢产物的变化规律，但其分泌的具体物质及其含量还需进一步研究。

参考文献

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[2]吕子明，姜永涛，吴立军，刘珂.人工蛹虫草子实体化学成分研究[J].中国中药杂志，2008，33（24）：2914-2916.

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