网站首页  词典首页

请输入您要查询的论文:

 

标题 CSFV的反向遗传系统
范文 赵妍
【摘 要】对于家猪和野猪来说,猪瘟是一种具有极高传染力及高致死率的烈性传染病。猪瘟是由猪瘟病毒(Classic Swine Fever Virus, CSFV)引起的病毒性传染病,CSFV属于黄病毒科,瘟病毒属,是一种单股正义RNA病毒。在CSFV的研究当中,反向遗传学应用十分广泛,论文主要介绍几种比较成熟的CSFV反向遗传系统。近年来,反向遗传学在CSFV的研究方面得到不断发展,论文就CSFV的几种反向遗传系统进行系统阐述,以期为CSFV的研究及防控提供参考。
【关键词】CSFV;猪瘟;反向遗传学
【Keywords】CSFV; classical swine fever; reverse genetics
【中图分类号】S852.65? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?【文献标志码】A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?【文章编号】1673-1069(2018)12-0182-02
1 引言
反向遗传学是利用病毒的全长基因组来产生完整病毒的方法,是现在病毒学研究中最强有力的工具。反向遗传学通常用于研究病毒复制、感染、蛋白功能、病毒与宿主的相互作用、抗病毒及疫苗研究[1]。近年来,反向遗传学在CSFV的研究方面得到不断发展,本文就CSFV的几种反向遗传系统进行系统阐述,以期为CSFV的研究及防控提供参考。据统计,我国每年因猪瘟造成的经济损失已超过100亿元。猪瘟严重阻碍养殖业的健康发展,并对食品安全造成威胁。因此,对该病进行全面、综合防控,具有必要的现实意义。本文对CSFV及功能相关基因、蛋白的研究进展进行介绍,为全面了解CSFV、全方位防控猪瘟提供理论支持。
2 CSFV的几种反向遗传系统
2.1 T7 RNA聚合酶介导的体外转录反向遗传学系统
T7 RNA聚合酶,是一种高度特异识别T7启动子序列的DNA依赖的5'→3'RNA聚合酶。T7 RNA Polymerase可以催化单链或双链DNA T7启动子下游NTP的掺入,合成与T7启动子下游的模板DNA互补的RNA[2]。
Meyers(Meyers et al., 1996)首先对CSFV 5到3进行了全基因组鉴定,将CSFV全基因组克隆到低拷贝质粒中,并在基因组3端加入T7启动子,利用Srf I将质粒线性化后,在T7 RNA聚合酶作用下体外转录得到RNA,并转染进SK6细胞系中拯救病毒,这一方法在现在的CSFV研究中依然应用十分广泛。Fan(Fan et al., 2009)將上述方法进行了改进,将由T7 RNA聚合酶体外转录产生的vRNA转染到BHK21细胞系中,培养一段时间后,将含有病毒的上清感染PK15细胞,用此方法得到的CSFV病毒滴度是之前的8倍左右。
2.2 T7 RNA聚合酶介导的体内转录反向遗传学系统
Gennip(Gennip et al., 1999)建立了一种更方便、高效的体内转录反向遗传系统。首先他建立了可以稳定表达T7 RNA聚合酶的SK6细胞系SK6-T7 RNA pol,将线性化的CSFV cDNA转染该细胞系,转录过程在细胞中完成并得到病毒RNA,产生CSFV病毒,该方法大大提高了病毒滴度,其滴度约为体外转录的200倍[3]。Bergeron(Bergeron, 2002)通过在CSFV 3端插入了HDV核酶及T7终止子,构建了一种新型的基于T7 RNA聚合酶的体内转录反向遗传学系统,该系统不需要Srf I就能在CSFV末端形成精确的3NCR,节约了构建成本。
2.3 II型RNA聚合酶介导的反向遗传学系统
Li(Li et al., 2013)在CSFV 5NCR加入CMV启动子、T7启动子和HamRZ,在3NCR加入HdvRZ,T7终止子和SV40 polyA,HamRZ与HdvRZ可以生成正确的5NCR及 3NCR,且能在T7 RNA聚合酶或者II型RNA聚合酶的作用下进行转录,该方法拯救的病毒滴度是体外转录的120倍。
2.4 I型RNA聚合酶介导的反向遗传学系统
本实验室在上述基础上,构建了一种新的依赖pol Ⅰ拯救病毒的CSFV cDNA克隆,我们在PK15细胞基因组中扩增得到猪的启动子,并参照文献合成在哺乳动物细胞中具有极高终止效率的鼠终止子,分别插入CSFV 5NCR之前和3NCR之后。该系统能直接将质粒转染到细胞中,拯救出CSFV病毒,这种基于pol Ⅰ启动子的反向遗传操作系统能产生具有精确末端基因组的CSFV,且具有更高的拯救效率,为后续修饰性减毒活疫苗和标记疫苗的研发奠定了坚实的基础。
3 带有标记的CSFV反向遗传系统
基于传统的反向遗传系统,具有标记或定量功能的CSFV cDNA克隆被设计出来,如在Li实验组建立了一种简化的中和抗体试验,用于检测CSFV,首先在Npro后插入了EGFP基因,在病毒产生的同时合成EGFP,从而省去荧光染色,达到检测病毒的目的[4]。本实验室在1.4中的反向遗传系统的基础上,在Npro后面加入了Rluc基因,得到了可以用于定量实验的CSFV反向遗传系统,即可以通过收集Rluc氧化过程中释放的生物荧光,定量地检测转录因子与目的基因的相互作用。
帶有标记的CSFV反向遗传系统在传统的反向遗传系统的基础上,进一步简化了实验步骤,在达到实验目的的同时,使反应更加快速,简便,增加了方法的实用性,为后续开展修饰性减毒活疫苗和标记疫苗的研发做了很好的铺垫。
4 展望
反向遗传操作系统为RNA 病毒研究提供了一个强有力的平台,能够恢复具有全长病毒基因组的病毒[5]。利用这个平台,人们可以通过基因重组、基因突变等 手段来研究病毒的复制、感染,病毒蛋白的功能、病毒与宿主细胞之间的关系。抗病毒策略和标记疫苗的发展也离不开反向遗传操作,如找出与毒力相关性基因,对其进行缺失或修饰处理,从而得到新的无毒或减毒毒株,以此制备新型的减毒活疫苗,同时可以制备嵌合抗体,开发多价疫苗[6]。反向遗传系统作为动物病毒的研究方法,已广泛应用于动物疫苗、CSFV毒力机制及蛋白功能研究中,极大地推动了动物病毒的研究发展,为疾病的研究及防控起着重要作用。
【参考文献】
【1】Bergeron, L.J. Development and comparison of procedures for the selection of delta ribozyme cleavage sites within the hepatitis B virus[J]. Nucleic Acids Research, 2002(30): 4682-4691.
【2】Fan, Y.F., Zhao, Q.Z., Zhao, Y., etc. Recovery of the Infectious Classical Swine Fever Virus from the Cloned cDNA of Low Temperature Attenuated Thiverval Strain[J]. Chinese Journal of Animal & Veterinary Sciences,2009(40), 1420-1425.
【3】Gennip, H.G.P.v., Rijn, P.A.v., Widjojoatmodjo, M.N., etc.Recovery of infectious classical swine fever virus (CSFV) from full-length genomic cDNA clones by a swine kidney cell line expressing bacteriophage T7 RNA polymerase[J]. Journal of Virological Methods, 1999(78): 117.
【4】Li, C., Huang, J., Li, Y., etc. Efficient and stable rescue of classical swine fever virus from cloned cDNA using an RNA polymerase II system[J]. Archives of Virology ,2013(158): 901-907.
【5】Meyers, G., Thiel, H.J., Rümenapf, T . Classical swine fever virus: recovery of infectious viruses from cDNA constructs and generation of recombinant cytopathogenic defective interfering particles[J]. Journal of Virology,1996(70): 1588-1595.
【6】WU C W, CHIEN M S, HUANG C. Characterization of the swine U6 promoter for short hairpin RNA expression and its application to inhibition of virus replication[J]. J Biotechnol, 2013,168(1):78-84.
随便看

 

科学优质学术资源、百科知识分享平台,免费提供知识科普、生活经验分享、中外学术论文、各类范文、学术文献、教学资料、学术期刊、会议、报纸、杂志、工具书等各类资源检索、在线阅读和软件app下载服务。

 

Copyright © 2004-2023 puapp.net All Rights Reserved
更新时间:2025/3/16 3:30:35