| 标题 | CSFV的反向遗传系统 |
| 范文 | 赵妍 【摘 要】对于家猪和野猪来说，猪瘟是一种具有极高传染力及高致死率的烈性传染病。猪瘟是由猪瘟病毒（Classic Swine Fever Virus， CSFV）引起的病毒性传染病，CSFV属于黄病毒科，瘟病毒属，是一种单股正义RNA病毒。在CSFV的研究当中，反向遗传学应用十分广泛，论文主要介绍几种比较成熟的CSFV反向遗传系统。近年来，反向遗传学在CSFV的研究方面得到不断发展，论文就CSFV的几种反向遗传系统进行系统阐述，以期为CSFV的研究及防控提供参考。 【关键词】CSFV;猪瘟;反向遗传学 【Keywords】CSFV; classical swine fever; reverse genetics 【中图分类号】S852.65? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?【文献标志码】A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?【文章编号】1673-1069（2018）12-0182-02 1 引言 反向遗传学是利用病毒的全长基因组来产生完整病毒的方法，是现在病毒学研究中最强有力的工具。反向遗传学通常用于研究病毒复制、感染、蛋白功能、病毒与宿主的相互作用、抗病毒及疫苗研究[1]。近年来，反向遗传学在CSFV的研究方面得到不断发展，本文就CSFV的几种反向遗传系统进行系统阐述，以期为CSFV的研究及防控提供参考。据统计，我国每年因猪瘟造成的经济损失已超过100亿元。猪瘟严重阻碍养殖业的健康发展，并对食品安全造成威胁。因此，对该病进行全面、综合防控，具有必要的现实意义。本文对CSFV及功能相关基因、蛋白的研究进展进行介绍，为全面了解CSFV、全方位防控猪瘟提供理论支持。 2 CSFV的几种反向遗传系统 2.1 T7 RNA聚合酶介导的体外转录反向遗传学系统 T7 RNA聚合酶，是一种高度特异识别T7启动子序列的DNA依赖的5'→3'RNA聚合酶。T7 RNA Polymerase可以催化单链或双链DNA T7启动子下游NTP的掺入，合成与T7启动子下游的模板DNA互补的RNA[2]。 Meyers（Meyers et al.， 1996）首先对CSFV 5到3进行了全基因组鉴定，将CSFV全基因组克隆到低拷贝质粒中，并在基因组3端加入T7启动子，利用Srf I将质粒线性化后，在T7 RNA聚合酶作用下体外转录得到RNA，并转染进SK6细胞系中拯救病毒，这一方法在现在的CSFV研究中依然应用十分广泛。Fan（Fan et al.， 2009）將上述方法进行了改进，将由T7 RNA聚合酶体外转录产生的vRNA转染到BHK21细胞系中，培养一段时间后，将含有病毒的上清感染PK15细胞，用此方法得到的CSFV病毒滴度是之前的8倍左右。 2.2 T7 RNA聚合酶介导的体内转录反向遗传学系统 Gennip（Gennip et al.， 1999）建立了一种更方便、高效的体内转录反向遗传系统。首先他建立了可以稳定表达T7 RNA聚合酶的SK6细胞系SK6-T7 RNA pol，将线性化的CSFV cDNA转染该细胞系，转录过程在细胞中完成并得到病毒RNA，产生CSFV病毒，该方法大大提高了病毒滴度，其滴度约为体外转录的200倍[3]。Bergeron（Bergeron， 2002）通过在CSFV 3端插入了HDV核酶及T7终止子，构建了一种新型的基于T7 RNA聚合酶的体内转录反向遗传学系统，该系统不需要Srf I就能在CSFV末端形成精确的3NCR，节约了构建成本。 2.3 II型RNA聚合酶介导的反向遗传学系统 Li（Li et al.， 2013）在CSFV 5NCR加入CMV启动子、T7启动子和HamRZ，在3NCR加入HdvRZ，T7终止子和SV40 polyA，HamRZ与HdvRZ可以生成正确的5NCR及 3NCR，且能在T7 RNA聚合酶或者II型RNA聚合酶的作用下进行转录，该方法拯救的病毒滴度是体外转录的120倍。 2.4 I型RNA聚合酶介导的反向遗传学系统 本实验室在上述基础上，构建了一种新的依赖pol Ⅰ拯救病毒的CSFV cDNA克隆，我们在PK15细胞基因组中扩增得到猪的启动子，并参照文献合成在哺乳动物细胞中具有极高终止效率的鼠终止子，分别插入CSFV 5NCR之前和3NCR之后。该系统能直接将质粒转染到细胞中，拯救出CSFV病毒，这种基于pol Ⅰ启动子的反向遗传操作系统能产生具有精确末端基因组的CSFV，且具有更高的拯救效率，为后续修饰性减毒活疫苗和标记疫苗的研发奠定了坚实的基础。 3 带有标记的CSFV反向遗传系统 基于传统的反向遗传系统，具有标记或定量功能的CSFV cDNA克隆被设计出来，如在Li实验组建立了一种简化的中和抗体试验，用于检测CSFV，首先在Npro后插入了EGFP基因，在病毒产生的同时合成EGFP，从而省去荧光染色，达到检测病毒的目的[4]。本实验室在1.4中的反向遗传系统的基础上，在Npro后面加入了Rluc基因，得到了可以用于定量实验的CSFV反向遗传系统，即可以通过收集Rluc氧化过程中释放的生物荧光，定量地检测转录因子与目的基因的相互作用。 帶有标记的CSFV反向遗传系统在传统的反向遗传系统的基础上，进一步简化了实验步骤，在达到实验目的的同时，使反应更加快速，简便，增加了方法的实用性，为后续开展修饰性减毒活疫苗和标记疫苗的研发做了很好的铺垫。 4 展望 反向遗传操作系统为RNA 病毒研究提供了一个强有力的平台，能够恢复具有全长病毒基因组的病毒[5]。利用这个平台，人们可以通过基因重组、基因突变等 手段来研究病毒的复制、感染，病毒蛋白的功能、病毒与宿主细胞之间的关系。抗病毒策略和标记疫苗的发展也离不开反向遗传操作，如找出与毒力相关性基因，对其进行缺失或修饰处理，从而得到新的无毒或减毒毒株，以此制备新型的减毒活疫苗，同时可以制备嵌合抗体，开发多价疫苗[6]。反向遗传系统作为动物病毒的研究方法，已广泛应用于动物疫苗、CSFV毒力机制及蛋白功能研究中，极大地推动了动物病毒的研究发展，为疾病的研究及防控起着重要作用。 【参考文献】 【1】Bergeron， L.J. Development and comparison of procedures for the selection of delta ribozyme cleavage sites within the hepatitis B virus[J]. Nucleic Acids Research， 2002（30）： 4682-4691. 【2】Fan， Y.F.， Zhao， Q.Z.， Zhao， Y.， etc. Recovery of the Infectious Classical Swine Fever Virus from the Cloned cDNA of Low Temperature Attenuated Thiverval Strain[J]. Chinese Journal of Animal & Veterinary Sciences，2009（40）， 1420-1425. 【3】Gennip， H.G.P.v.， Rijn， P.A.v.， Widjojoatmodjo， M.N.， etc.Recovery of infectious classical swine fever virus （CSFV） from full-length genomic cDNA clones by a swine kidney cell line expressing bacteriophage T7 RNA polymerase[J]. Journal of Virological Methods， 1999（78）： 117. 【4】Li， C.， Huang， J.， Li， Y.， etc. Efficient and stable rescue of classical swine fever virus from cloned cDNA using an RNA polymerase II system[J]. Archives of Virology ，2013（158）： 901-907. 【5】Meyers， G.， Thiel， H.J.， Rümenapf， T . Classical swine fever virus： recovery of infectious viruses from cDNA constructs and generation of recombinant cytopathogenic defective interfering particles[J]. Journal of Virology，1996（70）： 1588-1595. 【6】WU C W， CHIEN M S， HUANG C. Characterization of the swine U6 promoter for short hairpin RNA expression and its application to inhibition of virus replication[J]. J Biotechnol， 2013，168（1）：78-84. |
| 随便看 |
|
科学优质学术资源、百科知识分享平台，免费提供知识科普、生活经验分享、中外学术论文、各类范文、学术文献、教学资料、学术期刊、会议、报纸、杂志、工具书等各类资源检索、在线阅读和软件app下载服务。