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标题 香砂六君子汤对慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜核因子—κB p65活化水平及其介导炎性级联反应的影响
范文 成映霞 周语平 段永强 王强 杨亚楠 李兰珍 杨晓轶 段云燕 杜娟 王庆胜



摘要：目的 观察香砂六君子汤对脾胃虚弱型慢性萎缩性胃炎（CAG）大鼠胃黏膜组织病理改变、核因子-κB （NF-κB）p65活化水平及其介导的炎性因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-8和IL-12表达的影响，探讨其作用机制。方法 实验大鼠按随机数字表法分为空白组和造模组，采用综合法制作脾胃虚弱型CAG大鼠模型，将成模大鼠随机分为模型组、阳性对照组和香砂六君子汤高、中、低剂量组。空白组和模型组予10 mL/（kg·d）蒸馏水灌胃，香砂六君子汤高、中、低剂量组分别予24、12、6 g/（kg·d）香砂六君子汤药液灌胃，阳性对照组予0.3 g/（kg·d）维酶素药液灌胃，给药120 d后检测大鼠胃黏膜TNF-α、IL-1β、IL-8和IL-12含量，实时荧光定量PCR检测大鼠胃黏膜组织NF-κB p65及下游炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-12基因表达，Western blot检测NF-κB p65蛋白表达。结果 与空白组比较，模型组大鼠一般生存状况较差，病理显示胃黏膜明显变薄，腺体萎缩、排列稀疏而紊乱；胃黏膜组织NF-κB p65 mRNA和蛋白表达显著升高（P<0.01），促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-8和IL-12含量及mRNA表达显著升高（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，香砂六君子汤高剂量组大鼠一般生存状况显著改善，胃黏膜萎缩变薄等病理显著改善，胃黏膜组织NF-κB p65 mRNA和蛋白表达显著降低（P<0.05，P<0.01），TNF-α、IL-1β、IL-8和IL-12含量及mRNA表达显著降低（P<0.05）。结论 香砂六君子汤可能通过下调NF-κB p65基因和蛋白表達，抑制促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-8和IL-12异常分泌而发挥保护胃黏膜的作用。
关键词：香砂六君子汤；慢性萎缩性胃炎；核因子-κB p65；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-1β；白细胞介素-8；白细胞介素-12；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.05.012
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）05-0050-06
Effects of Xiangsha Liujunzi Decoction on Activated Levels of NF-κB p65
and Inflammatory Cascade Reaction Mediated by NF-κB p65 of
Gastric Mucosa in Chronic Atrophic Gastritis Rats
CHENG Ying-xia1，2，3， ZHOU Yu-ping2， DUAN Yong-qiang2，3， WANG Qiang2，3， YANG Ya-nan4， LI Lan-zhen2，
YANG Xiao-yi1， DUAN Yun-yan2， DU Juan2， WANG Qing-sheng1
1. Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology for TCM of Gansu Province， Lanzhou 730000， China；2. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 3. Key Laboratory of Traditional Chinese Herbs and Prescription Innovation and Transformation of Gansu Province， Lanzhou 730000， China； 4. Xian Jiaotong
University Health Science Center， Xi'an 710061， China
Abstract： Objective To observe the effects of Xiangsha Liujunzi Decoction on histopathological changes of gastric antrum， activated levels of NF-κB p65 in gastric mucosa and expression levels of inflammatory factors including TNF-α， IL-1β， IL-8 and IL-12 mediated by NF-κB p65 of chronic atrophic gastritis （CAG） rats with spleen-stomach deficiency syndrome； To discuss its mechanism of action. Methods The experimental rats were
基金项目：国家自然科学基金（81260519、81760830）；甘肃省自然科学基金（1610RJZA063）；甘肃省中医药管理局资助项目（GZK-2014-73）；甘肃省中医方药挖掘与创新转化重点实验室开放基金（ZYFYZH-KJ-2016-006）
divided into blank group and model group according to the random number table method. The model of CAG rats with spleen-stomach deficiency syndrome was successfully duplicated by comprehensive method. And then the rats were randomly divided into model group， Xiangsha Liujunzi Decoction high-， medium- and low-dose groups and positive control group. The rats in blank and model groups were given 10 mL/（kg·d） distilled water， and Xiangsha Liujunzi Decoction high-， medium- and low-dose groups were given 24， 12， 6 g/（kg·d） Xiangsha Liujunzi Decoction respectively， the positive control group was treated with 0.30 g/（kg·d） vitamin enzyme. 120 days later， the levels of TNF-α， IL-1β， IL-8 and IL-12 in gastric mucosa were detected. Gene expression of NF-κB p65 in gastric mucosa and the above inflammatory factors were detected with real-time fluorescence quantitative PCR， and protein expression of NF-κB p65 was detected by Western blot. Results Compared with the blank group， the general living condition of the model rats was poor， and the pathological changes showed that the gastric mucosa became thinner， the glands were atrophic and its arrangement was sparse and disorder. The expression of NF-κB p65 mRNA and protein in gastric tissue significantly increased （P<0.01）， and the levels of TNF-α， IL-1β， IL-8 and IL-12 significantly increased （P<0.05， P<0.01）. Compared with model group， the normal survival status of the rats in Xiangsha Liujunzi Decoction high- and medium-dose groups was significantly improved， and the pathological changes of the gastric mucosal atrophy and other pathological changes were significantly improved. Gene and protein expression of NF-κB p65 in gastric tissues decreased significantly （P<0.05， P<0.01）， and mRNA and the contents of TNF-α， IL-1β， IL-8 and IL-12 decreased significantly （P<0.05）. Conclusion Xiangsha Liujunzi Decoction plays an important role in protecting the gastric mucosa by down-regulating the expression of NF-κB p65 gene and protein and inhibiting the abnormal secretion of proinflammatory cytokines TNF-α， IL-1β， IL-8 and IL-12.
Keywords： Xiangsha Liujunzi Decoction； chronic atrophic gastritis； NF-κB p65； TNF-α； IL-1β； IL-8； IL-12； rats
慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）病理机制之一在于胃黏膜慢性炎性级联反应放大和细胞增殖与凋亡失衡而造成胃黏膜持续损伤[1]。临床应用香砂六君子汤及其加减方治疗CAG疗效显著[2]。前期研究显示，香砂六君子汤可改善脾胃虚弱型CAG大鼠胃排空功能、促进胃蛋白酶活性和胃壁细胞能量代谢相关酶活性以及胃黏膜分泌功能；并可调控白细胞介素（IL）-6/IL-10分泌平衡及上调热休克蛋白70（HSP70）表达，下调低氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因和蛋白表达而保护胃黏膜[3-5]。另有研究表明，与细胞分化增殖相关的核因子（NF）-κB p65异常活化并诱导肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-1β、IL-8和IL-12等炎性因子合成分泌水平增高，由此产生的炎性级联放大反应在诱发CAG胃黏膜细胞生理功能紊乱及病理变化中起重要作用[6-8]。本实验观察CAG大鼠胃黏膜组织病理改变、NF-κB p65高表达而诱生的下游促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-12基因和蛋白表达及香砂六君子汤的干预效应，进一步探讨该复方干预CAG的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级健康Wistar大鼠54只，雌雄各半，2月龄，体质量（160±10）g，甘肃中医药大学医学实验中心，动物合格证号SCXK（甘）2011-0001-0001010。饲养于甘肃中医药大学SPF级实验室，室温（23±2）℃，相对湿度45%～55%，自由摄食饮水。实验动物处理遵守中国国家健康与医学研究委员会动物道德准则。
1.2 药物及制备
香砂六君子汤按人参∶白术∶茯苓∶陈皮∶姜半夏∶砂仁∶木香∶生姜∶炙甘草=6∶12∶12∶ 5∶6∶5∶2∶12∶4比例配制（上述饮片均购自兰州复兴厚中药材有限责任公司，并经甘肃中医药大学药学院中药生药学教研室杨扶德教授鉴定合格），全方加10倍量蒸馏水浸泡2 h后，按常法煎煮2次，每次40 min，滤出药液加热浓缩至每1 mL药液含原药材2 g，冷却后置于4 ℃冰箱保存备用，使用时稀释至所需浓度；维酶素片，新乡恒久远药业有限公司，0.2 g/片，批号20140108。
1.3 主要试剂及仪器
吲哚美辛，上海信谊黄河制药有限公司；脱氧胆酸钠，西格玛奥德里奇上海贸易有限公司；乙醇，天津市富宇精细化工有限公司；氨水，白银良友化学试剂有限公司；考马斯亮兰蛋白测定试剂盒，南京建成生物科技有限公司；TNF-α、L-1β、IL-8、IL-12试剂盒，杭州联科生物技术有限公司；引物GAPDH、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-12，美国Gene Copoeia公司；Trizol试剂、反转录及qRT-PCR试剂盒，美国Promega Corporation公司；一抗NF-κB p65，美国ImmunoWay公司；辣根酶标记山羊抗兔IgG，北京中杉金桥生物科技有限公司。HH-4数显恒温水浴箱，江苏省金坛市友联仪器研究所；Benchmark Plus酶联免疫检测仪、BIOMATE 3S核酸蛋白测定仪、S1000TM反转录仪、Chemi DOC XRS+凝胶成像分析系统、CFX96TM Optics Module PCR仪，美国BIO-RAD公司。
2 实验方法
2.1 造模和分组
除空白组8只大鼠正常饲养不予造模外，其余大鼠参照文献[9]方法，采用复合慢性损伤因素联合造模。①60%乙醇，每3 d空腹灌胃1次，每次8 mL/kg；②20 mmol/L脱氧胆酸钠灌胃，每次8 mL/kg，每日1次；③每日配制0.1%氨水作为大鼠日常饮用水自由饮用，记录每日饮用量；④0.05%吲哚美辛灌胃，每次8 mL/kg，每日1次；⑤采用饥饱失常喂养法，2 d足量喂养，1 d禁食，连续造模40周。实验期间每2 d足量喂养并记录饲料消耗量，每3 d测定体质量增加量。待综合法造模30周后，每隔1周随机抽检大鼠，取胃黏膜组织做病理检查并判定胃黏膜萎缩病理变化，评价CAG模型大鼠胃黏膜萎缩病理形成后，将CAG大鼠按随机数字表法分为模型组、阳性对照组和香砂六君子汤高、中、低剂量组（中药高、中、低剂量组），每组8只。
2.2 给药
中药高、中、低剂量组每日分别给予24、12、6 g/kg 香砂六君子汤药剂灌胃（相当于60 kg成人剂量的12、6、3倍），阳性对照组每日给予0.3 g/kg维酶素灌胃（相当于60 kg成人剂量的6倍），等效剂量按人与动物体型系数折算[10]，空白组和模型组每日给予等体积蒸馏水灌胃。给药体积均为10 mL/kg，共120 d。
2.3 一般观察
观察并记录各组大鼠活动度、被毛色泽、粪便性状并测定平均每日摄食量、平均每日体质量增加量。
2.4 标本采集与检测
各组大鼠末次灌胃给药后禁食不禁水24 h，测体质量并用乌拉坦（1 g/kg）麻醉后全部杀检。胃黏膜组织匀浆制备：低温下快速剖取近胃窦黏膜组织，以冰冷生理盐水冲洗，称重后快速剪碎，置于匀浆器中，用组织重9倍生理盐水匀浆，3500 r/min离心10 min，取上清液，置于4 ℃冰箱保存，按ELISA试剂盒说明待测胃黏膜TNF-α、IL-1β、IL-8和IL-12含量。
2.5 qRT-PCR检测胃黏膜组织核因子-κB p65、肿瘤坏死因子-α及白细胞介素-1β、8、12的基因表达
采用Trizol法提取总RNA，测定其OD260/OD280均在1.8～2.0之间，经总RNA琼脂糖凝胶电泳检测符合纯度要求，反转为cDNA，以GAPDH作为内参基因，反应体系及参数依据GoTaq 2-Step RT-qPCR试剂盒说明书设置，相同模板相同基因设3个复孔、6次平行实验，得到各扩增反应的Ct值。采用样点拟合法分析结果得到目的基因和β-actin的Ct值，以β-actin为内参，比较Ct值法计算相对表达量：ΔΔCt=（测试组目的基因Ct值-测试组内参基因Ct值）-（对照组目的基因Ct值-对照组内参基因Ct值），相对表达量为2-ΔΔCt。
2.6 Western blot检测胃黏膜组织核因子-κB p65的蛋白表达
常规提取组织蛋白，BCA试剂盒进行蛋白定量，20 μg/道上样量进行SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜后，5%牛血清白蛋白封闭后分别加入一抗。GAPDH一抗溶液（1∶700）配制：GAPDH一抗10 μL，牛奶封闭液7 mL；NF-κB p65一抗溶液（1∶750）配制：NF-κB p65一抗1 μL，封闭液7.5 mL。4 ℃摇床过夜，洗涤后加入HRP标记羊抗兔二抗。辣根酶标记山羊抗兔（1∶7500）二抗溶液配制：山羊抗兔二抗2 μL，牛奶封闭液15 mL。室温孵育1 h，采用化学发光底物进行化学发光，暗室曝光显影，定影后用Bio-RAD Quantity one图像分析软件进行扫描分析。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较用方差分析，方差齐用S-N-K法比较，方差不齐用Tamhanes T2法比较。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 一般状况
空白组大鼠始终表现为反应灵敏，活动及摄食量均正常，体质量正常增长。模型组大鼠第6～8周后出现少食怠动、消瘦倦卧、被毛稀疏失泽、反应迟钝、每日摄食量和体质量增加均减缓等。各给药组大鼠从给药第10周开始少食怠动、消瘦倦卧、被毛稀疏失泽、反应迟钝逐渐减轻或消失，活动度及每日摄食量趋于正常，尤其以中药高剂量组大鼠一般生存状况改善明显。
4.2 病理变化
空白组大鼠胃黏膜上皮细胞、腺体排列规整，大小及形状较一致，黏膜固有层未见炎性细胞或仅见少量淋巴细胞及嗜酸性细胞散在，无充血、水肿及肠上皮化生；模型组大鼠胃黏膜明显变薄，甚至可见胃黏膜全层萎缩，腺体排列稀疏而紊乱，大量腺体肠化，部分腺体增生性囊状扩张，黏膜及黏膜下层炎性细胞浸润，可见显著肠化病理改变；中药高剂量组大鼠胃黏膜轻度变薄，腺体排列较为整齐，炎性细胞浸润不明显，无肠化病理改变；中药中剂量组大鼠胃黏膜轻度变薄，腺体排列稀疏，排列较规整，可见少量炎性细胞浸润，偶见散在杯状细胞，可见肠化病理改变；中药低剂量组大鼠胃黏膜轻度变薄，腺体排列稀疏而稍顯紊乱，少量腺体扩张，少量炎性细胞浸润，可见肠化病理改变；阳性对照组大鼠胃黏膜较薄，腺体数量减少，排列整齐，大量腺体增生性扩张，少量炎性细胞浸润，未见明显肠化。结果见图1。
4.3 香砂六君子汤对模型大鼠胃黏膜组织核因子-κB p65基因和蛋白表达的影响
与空白组比较，模型组大鼠胃黏膜组织NF-κB p65基因和蛋白表达均显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，中药高剂量组大鼠胃黏膜组织NF-κB p65基因和蛋白表达均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见表1、图2。
4.4 香砂六君子汤对模型大鼠胃黏膜组织肿瘤坏死因子-α mRNA表达和含量的影响
与空白组比较，模型组大鼠胃黏膜组织TNF-α mRNA表达和含量均显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，中药高剂量组大鼠胃黏膜组织TNF-α mRNA表达和TNF-α含量均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表2。
4.5 香砂六君子汤对模型大鼠胃黏膜组织白细胞介素-1β mRNA表达和含量的影响
与空白组比较，模型组大鼠胃黏膜组织IL-1β mRNA表达和含量均显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，中药高剂量组和阳性对照组大鼠胃黏膜组织IL-1β mRNA表达和含量均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表3。
4.6 香砂六君子汤对模型大鼠胃黏膜组织白细胞介素-8 mRNA表达和含量的影响
与空白组比较，模型组大鼠胃黏膜组织IL-8 mRNA表达和含量均显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，中药高剂量组和阳性对照组大鼠胃黏膜组织IL-8 mRNA表达和含量均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见表4。
4.7 砂六君子汤对模型大鼠胃黏膜组织白细胞介素-12 mRNA表达和含量的影响
与空白组比较，模型组大鼠胃黏膜组织IL-12 mRNA表达和含量均显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，中药高剂量组和阳性对照组大鼠胃黏膜组织IL-12 mRNA表达和含量均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见表5。
5 讨论
CAG属中医学“胃痞”范畴，香砂六君子汤是临床治疗脾胃虚弱，气机阻滞而变生胃痞的效方。相关研究显示，NF-κB p65异常活化及下游细胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6异常分泌或表达参与胃黏膜炎性反应和级联放大可加重胃黏膜损伤[1-3]，而香砂六君子汤是否通过调控上述效应指标异常表达而改善CAG胃黏膜损伤，这是本研究的重点。
NF-κB p65是多种组细胞内最重要的核转录因子，激活后参与多种基因表达和调控，并在炎症持续、氧化应激、细胞增殖和凋亡等病理过程中发挥作用[11]。若NF-κB被激活后进入细胞核内，可与多种炎性因子启动子区域中κB序列结合，通过调控一系列炎性因子（TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8和IL-12等）转录、表达引起炎性反应，而上述炎性因子又可进一步促进NF-κB活化而产生级联反应，从而使炎性反应长时间持续和病理损伤加重[12-13]。有关NF-κB与IL-1β、TNF-α级联响应效应的研究发现，当NF-κB活化后，可使机体细胞迅速产生IL-1β，刺激中性粒细胞引起炎症介质释放，又进一步促进NF-κB活化； 同时IL-1β能够刺激TNF-α、IL-8等其他细胞因子大量分泌，并形成级联释放而加重细胞炎症反应或造成组织损伤，而且NF-κB p65的活化水平可代表NF-κB的激活程度[14]。而TNF-α亦能增强自然杀伤细胞、辅助性T细胞及肿瘤浸润淋巴细胞的细胞毒性，释放大量氧自由基和一氧化氮，同时诱导IL-1、IL-6、IL-8、IL-12等细胞因子大量分泌，从而加重细胞损害[15-16]。
本实验结果显示，与空白组比较，模型组大鼠一般生存状况较差，胃黏膜组织NF-κB p65基因和蛋白表达均升高，TNF-α、IL-1β、IL-8和IL-12基因表达和分泌水平亦显著升高，提示CAG胃黏膜损伤与NF-κB p65高表达及其活化水平活跃而诱生的促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-8和IL-12异常分泌产生的炎性级联反应有关；与模型组比较，中药高剂量组和阳性对照组大鼠一般生存状况显著改善，胃黏膜组织NF-κB p65基因和蛋白表达均显著降低，TNF-α、IL-1β、IL-8和IL-12基因表达和含量均显著降低；且病理结果显示，模型组大鼠胃黏膜明显变薄，腺体萎缩、排列稀疏而紊乱病理改变，而中药高剂量组大鼠胃黏膜萎缩、变薄等病理显著改善，表明香砂六君子汤可通过下调NF-κB p65基因和蛋白的表达，进而抑制促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-8和IL-12的合成分泌，减轻由此产生的炎性级联放大反应，从而发挥保护胃黏膜的作用。
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（收稿日期：2017-08-14）
（修回日期：2017-09-20；编辑：华强）
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