| 标题 | 健脾解毒方对过表达HBx肝癌HepG2细胞PI3K/AKT通路的影响 |
| 范文 | 张斌 王晓薇 徐春江 丁慎华 朱薇珊 钱雪梅 摘要：目的 观察健脾解毒方对过表达乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）的肝癌细胞增殖及PI3K/AKT信号通路相关因子表达的影响。方法 构建过表达HBx肝癌的HepG2细胞，给予不同浓度健脾解毒方药物血清进行干预，实验分为肝癌细胞空白组、pcDNA3.1组、pcDNA3.1-HBx组和健脾解毒方低、中、高剂量组。采用MTT法及流式细胞仪检测细胞增殖及凋亡水平，采用Western blot检测肝癌细胞p-PI3K、p-AKT蛋白表达。结果 成功构建过表达HBx的肝癌HepG2细胞，发现有促进肝癌细胞增殖及上调p-PI3K及p-AKT表达的作用。健脾解毒方药物血清干预后，可不同程度抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡，以及下调p-AKT、p-PI3K表达的作用，而健脾解毒方低剂量组对p-PI3K表达作用不显著。结论 健脾解毒方有抑制肝癌细胞增殖及促进凋亡的作用，其机制与下调PI3K/AKT通路相关因子表达有关。 关键词：肝癌细胞；PI3K/AKT信号通路；乙型肝炎病毒X蛋白；健脾解毒方 中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2019）03-0056-04 Abstract： Objective To study the effects of Jianpi Jiedu Prescription on proliferation of HBx overexpression hepatoma cells and expression of PI3K/AKT signaling pathway-related factors. Methods HepG2 cells of HBx overexpression were established. Different concentrations of Jianpi Jiedu Prescription serum were given for intervention. The study was divided into hepatoma cells blank group， pcDNA3.1 group， pcDNA3.1-HBx group and Jianpi Jiedu Prescription low-， medium- and high-dosage groups. Cell proliferation and apoptosis were detected by MTT assay and flow cytometry. The expressions of p-PI3K and p-AKT protein were detected by Western blot. Results HepG2 cells of HBx overexpression were successfully constructed. It was found that HBx overexpression could promote the proliferation of hepatoma cells and up-regulate the expressions of p-PI3K and p-AKT. After intervention with serum of Jianpi Jiedu Prescription， it was found that each Jianpi Jiedu Prescription group inhibited the proliferation of hepatoma cells， promoted apoptosis of hepatoma cells and decreased the expressions of p-AKT and p-PI3K， but Jianpi Jiedu Prescription low-dosage group had no significant effect on p-PI3K. Conclusion Jianpi Jiedu Prescription has the effect of inhibiting the proliferation and promoting apoptosis of hepatoma cells， and its mechanism is related to down-regulating the expression of PI3K/AKT pathway-related factors. Keywords： hepatoma cells； PI3K/AKT signaling pathway； HBx； Jianpi Jiedu Prescription 原發性肝癌（primary liver cancer，PLC）是发病率较高的恶性肿瘤，其全球发病率和死亡率分别居所有肿瘤的第7位和第4位[1]，治疗难度极大，预后很差。目前PLC机制尚不清楚，因而加强其发病机制研究，并寻找有效治疗手段是肝癌防治的关键所在[2-3]。PI3K/AKT信号通路在肝癌细胞生长、分化、增殖、迁移和存活中扮演重要角色，与肝癌发生发展密切相关[4-5]。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）慢性感染是肝细胞癌发病的独立高危因素，其中乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）是一种重要的反式作用因子，能广泛激活多种原癌基因的转录表达，是肝细胞恶性转化的重要原因，被认为在肝癌发生过程中发挥直接促癌作用[6-8]。我们前期通过二甲基亚硝胺诱导大鼠肝癌模型，采用健脾解毒方对其干预后，发现有延缓肝癌发病的作用，其机制与中药下调PI3K/AKT信号通路相关因子表达有关[9-10]。为进一步探索其机制，本研究构建过表达HBx的肝癌HepG2细胞，采用健脾解毒方药物血清进行干预，观察其对过表达HBx的肝癌细胞增殖及PI3K/AKT信号通路相关因子表达的影响。 1 实验材料 1.1 细胞株 肝癌HepG2细胞，中国科学院上海细胞库提供。采用RPMI1640进行细胞培养（培养液含100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素及10%胎牛血清），其中培养箱条件设置为37 ℃、5%CO2，每隔3～4 d进行传代，选择对数生长期的肝癌细胞用于实验。 1.2 动物 雄性SD大鼠20只，体质量（100±10）g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物许可证号SXCK（沪）2015-0008。饲养于上海中医药大学附属普陀医院SPF级动物房，普通饲料喂养，自由饮水。 1.3 药物 健脾解毒方（黄芪38 g，猪苓15 g，八月札18 g，麸炒白术24 g，仙鹤草18 g，石见穿18 g，薏苡仁12 g，野葡萄藤18 g）10剂，饮片由上海中医药大学附属普陀医院药剂科提供，常规水煎浓缩成1000 mL，含原药材1.5 g/mL，4 ℃冰箱保存备用。 1.4 主要试剂与仪器 胎牛血清、0.25%胰酶-EDTA、RPMI 1640培养液及小牛血清，Thermo Fisher Scientific公司；DMSO、MTT和Trizol RNA试剂，Sigma公司；鼠抗人SEPP1单克隆抗体及兔抗人GAPDH单克隆抗体，上海碧云天生物技术有限公司。96孔培养板，Nunc公司；电子天平，MettlerToledo公司；CO2培养箱，Binder公司；CK40型多功能倒置相差显微镜，Olympus公司。 2 实验方法 2.1 中药药物血清制备 大鼠随机分为健脾解毒方药物血清组和对照组。健脾解毒方药物血清组大鼠给予50 g/kg健脾解毒方灌胃（按成人体质量用药剂量换算），对照组大鼠灌服等体积生理盐水，连续5 d。实验前禁食12 h，末次给药后2 h。腹主动脉采血，离心，分离血清，56 ℃灭活，使用0.22 μm微孔过滤除菌，分装，置于-80 ℃冰箱保存。 2.2 重组表达载体的构建及鉴定 用限制性内切酶XhoI和EcoRI对Plvx-ires-zsgreen1表达载体和目的片段分别进行双酶切，酶切产物采用DNA凝胶回收试剂盒回收，取4 μL回收后的目的片段与2 μL载体，用1 μL T4 DNA连接酶于16 ℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，接种于含氨苄的LB平板上培养，37 ℃过夜培养，次日挑单克隆扩大培养并小量提取质粒，对提取的重组质粒进行EcoRI单酶切鉴定，同时进行PCR扩增并用琼脂糖凝胶电泳检测。将鉴定结果正确质粒和阳性菌送到上海华大基因生物公司进行测序。 2.3 细胞培养 将冻存于液氮中的HepG2细胞接种于含10%胎牛血清DMEM培养液中，37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养，细胞处于对数生长期时进行传代，每2～3 d换液1次，长满后常规胰蛋白酶消化法传代培养。48 h后收集细胞进行实验。实验分为肝癌细胞空白组、pcDNA3.1组（将空质粒pcDNA3.1转染肝癌细胞后进行培养）、pcDNA3.1-HBx组（将HBx转染肝癌细胞后进行培养）和中药低剂量组（在pcDNA3.1- HBx转染肝癌细胞后加入体积分数为10%健脾解毒方药物血清）、中剂量组（在pcDNA3.1-HBx轉染肝癌细胞后加入体积分数为15%健脾解毒方药物血清）、高剂量组（在pcDNA3.1-HBx转染肝癌细胞后加入体积分数为20%健脾解毒方药物血清）。 2.4 MTT法检测细胞增殖 取对数生长期的肝癌细胞接种于96孔培养板中，细胞浓度为1×104，每孔约200 μL。培养24 h后，弃培养液，重新加入温育液，于培养24 h及48 h每孔加入20 μL MTT液（5 mg/mL），培养4 h后弃上清，加入DMSO，采用酶标仪进行测定，于酶标仪490 nm波长处测量吸光度（OD）。抑制率（%）=（1-用药组平均OD值÷对照组平均OD值）×100%。 2.5 细胞凋亡率检测 收集培养肝癌细胞，1000 r/min离心5 min，弃上清液，PBS进行清洗2次，将缓冲液、AnnexinⅤ-FITC 抗体及PI染液依次加入，室温避光放置15 min，流式细胞仪进行检测。实验重复3次。 2.6 Western blot检测p-PI3K、p-AKT蛋白表达 以RIPR裂解液收获细胞，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清液并测定蛋白浓度；蛋白上样量为20 μg，SDS PAGE胶浓度为8%，蛋白转移至0.45 μm PVDF膜上，孵一抗（p-PI3K、p-AKT、GAPDH抗体均为1∶1000）4 ℃过夜，TBST洗涤3次，孵二抗1∶2000，室温2 h；TBST洗涤6次；ECL发光试剂盒暗室发光、显影、定影。Bio-Rad凝胶成像系统获取图像，采用Image J图像软件计算灰度值。 3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，两组间均数比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。 4 结果 4.1 真核表达载体 pcDNA3.1（+）-HBx构建及鉴定 将pcDNA3.1（+）酶切片段与HBx片段连接，阳性克隆通过XhoI和XbaI进行双酶切，用于连接和转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑单克隆进行培养扩增，提取质粒，限制性内切酶XhoI对重组质粒进行单酶切鉴定，电泳结果显示有235 bp的HBx条带和4128 bp的载体条带，与预期片段大小相符，经测序进一步证明插入基因正确，获得pcDNA3.1（+）-HBx载体，表明HBx表达载体构建成功。见图1、图2。 4.2 健脾解毒方对肝癌细胞增殖的影响 与肝癌细胞空白组比较，pcDNA 3.1-HBx组肝癌细胞抑制率显著降低（P<0.01）；與pcDNA 3.1-HBx组比较，中药各剂量组肝癌细胞抑制率显著升高（P<0.01）。见表1。 4.3 健脾解毒方对肝癌细胞凋亡的影响 与肝癌细胞空白组比较，pcDNA 3.1-HBx组肝癌细胞凋亡率无明显差异；与pcDNA 3.1-HBx组比较，中药各剂量组肝癌细胞凋亡率显著升高（P<0.01），中药高剂量组升高最明显。见表2。 4.4 健脾解毒方对癌细胞p-PI3K、p-AKT蛋白表达的影响 与肝癌细胞空白组比较，pcDNA 3.1-HBx组肝癌细胞p-PI3K及p-AKT蛋白表达显著上调（P<0.01）；与pcDNA 3.1-HBx组比较，中药中、高剂量组p-PI3K、p-AKT蛋白表达显著下调（P<0.01）。见表3、图3。 5 讨论 HBV慢性感染是肝癌发病的独立高危因素。整合的HBV-DNA 基因组编码的HBx是一种重要的反式作用因子，能广泛激活多种原癌基因的转录表达，是肝细胞恶性转化的重要原因，被认为在肝癌发生过程中发挥直接促癌作用[6]。HBx蛋白可干扰癌细胞间的黏附连接，促进细胞外基质降解，诱导肝癌细胞发生上皮间叶表型转化，促进肝细胞癌侵袭转移。HBx在肝癌发病中与多种信号通路的参与密切相关，其中Wang等[7]将HBx基因转染HepG2肝癌细胞后发现有促进肝癌细胞增殖，其机制与激活PI3K/AKT信号通路的表达有关。Liu等[8]采用转染HBx基因的肝癌细胞接种裸鼠后发现有促进肿瘤转移的作用，其机制与PI3K/AKT信号通路的激活有关。本研究成功构建了过表达HBx的真核表达载体，通过转染肝癌HepG2细胞后，也发现有促进肝癌细胞增殖作用，表明HBx与肝癌的发生发展密切相关。 PI3K是一种脂类激酶，活化的PI3K可将磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸转化为磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）。PIP3可使其主要下游底物AKT准确定位到近膜区并发生构象变化，同时活化的AKT转位到细胞质和细胞核内，作用于下游底物，调控细胞代谢、蛋白合成、细胞增殖与凋亡等重要生理过程，参与细胞生长、增殖及分化调节。PI3K/AKT信号通路是一条广泛存在于细胞中的信号转导通路，在细胞增殖调控中起重要作用，其表达异常存在于多种癌细胞中，尤其与肝癌发病关系密切。本研究对过表达HBx的肝癌细胞进行了研究，发现HBx促进肝癌细胞增殖作用与上调p-PI3K及p-AKT的表达有关。 肝癌属中医学“臌胀”“肝积”“积聚”等范畴。多由饮食不节（洁）、情志不遂、劳倦等多种因素引起邪毒内生而引起，病机特点是本虚标实，本虚以脾气虚为主，标实为邪毒（热、湿热毒邪）郁肝，治以益气健脾、理气解毒。健脾解毒方为上海中医药大学范忠泽教授经验方，对多种恶性肿瘤有抑制作用，该方由黄芪、白术、猪苓、枳壳、八月札、石见穿及野葡萄藤等组成，具有健脾益气、化湿解毒功效。既往研究发现该方具有提高免疫、改善脏器功能及抗多种消化道肿瘤等功效，尤其对肝癌有较好的疗效[11-12]。我们前期研究中发现，该方可较好延缓二乙基亚硝胺诱导大鼠肝癌的发生和发展，其机制部分与调控PI3K/AKT信号通路的表达有关[9-10]。本研究采用健脾解毒方对过表达HBx的肝癌HepG2细胞开展研究，发现中药各剂量组有抑制肝癌细胞增殖作用，其机制与下调p-AKT蛋白表达有关（P<0.01），进一步通过对p-PI3K表达情况进行研究，发现除低剂量组作用不显著外，中药中、高剂量组均显著下调p-PI3K的表达（P<0.01），表明健脾解毒方抑制肝癌细胞作用可能与下调p-AKT及p-PI3K蛋白表达有关。 参考文献： [1] LAFARO K J， DEMIRJIAN A N， PAWLIK T M. 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