| 标题 | 不同病程糖尿病周围神经病变不同模型大鼠的神经病变相关指标的比较研究 |
| 范文 | 尹烨淋 王丽 摘要：为了探究常见糖尿病周围神经病变模型大鼠不同病程的神经病变相关指标的变化。采用数据库进行相关文献的检索，总结整理相关指标数据并进行比较研究。从而发现SD大鼠的神经病变相关指标的改变更早于Wistar大鼠和自发性糖尿病大鼠，故SD大鼠更适合作为糖尿病周围神经病变的模型大鼠用于实验研究。 关键词：糖尿病周围神经病变;SD大鼠;Wistar大鼠;自发性糖尿病大鼠 中图分类号：R587.1?文献标志码：A?文章编号：1007-2349（2021）01-0087-07 糖尿病周围神经病变（Diabetic Peripheral Neuropathy，DPN）是指周围神经功能障碍，包含脊神经、颅神经及植物神经病变，为糖尿病常见并发症之一，其临床表现为肢体疼痛、麻木、感觉异常等[1]，其进一步发展可引起坏疽，甚至发展为非创伤性截肢[2]，故而通过动物实验研究探讨DPN的治疗和转归有着重要意义。目前在DPN相关实验中最常见的模型大鼠分别是腹腔注射链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）的两类糖尿病大鼠：SD大鼠和Wistar大鼠，以及自发性糖尿病大鼠。根据2014年EASD学组[3]建议，可以从以下四方面描述DPN模型大鼠：行为学、神经功能、生物标记物以及神经结构。本研究旨在总结不同病程的上述三种DPN模型大鼠的上述四个方面指标的变化特点。 1?实验动物模型 糖尿病大鼠常用的模型分为三类：一类是通过对实验动物的全部或部分切除，引起其胰岛素缺乏而建立;第二类是通过化学药物损伤其胰岛功能建立的;第三类是自发性糖尿病动物[4]。对于上述三类模型，第一类已经很少建立，最常见的是第二类和第三类模型的建立。本研究将最近4年，可于CNKI以及PUBMED文献数据库通过检索词：“糖尿病周围神经病变 大鼠”检索到的关于DPN模型大鼠的具有特征性的研究进行整理，对相关实验设计常用的大鼠：SD大鼠、Wistar大鼠以及自发性糖尿病大鼠的相关数据进行总结分析。 2?实验性糖尿病模型大鼠相关数据的汇总 2.1?实验性糖尿病大鼠及造模方法 2.1.1?Wistar大鼠与SD大鼠的介绍?1Wistar大鼠为白色封闭群大鼠，1970年育成，是生物医学研究的大鼠历史最长的品系[5]。脾性温顺，抵御传染病能力较强，目前该品系常应用于神经-内分泌实验研究[6]。 2SD大鼠为白色封闭群大鼠，1925年用Wistar 大鼠培育而成，其特点为：生育多，成长较Wistar大鼠快[5]。目前已应用于生命科学研究，尤其在药理学、营养学、分泌学、肿瘤学方面应用最为广泛。研究发现，SD大鼠的神经系统与人类相似，故常应用于高级神经活动相关的研究[6]，可见在DPN的模型建立上，SD大鼠更具优势。 2.1.2?造模方法?STZ是一种广谱抗菌素，其对胰岛β细胞具有高度选择性的毒性而致其发生糖尿病。由于STZ对组织毒性较小，故动物存活生存率高，是全球常用的制造糖尿病动物的造模方法[7]。1型糖尿病与2型糖尿病的大鼠建模方式：（1）1型糖尿病：通过一次性注射大剂量的STZ，建立的大鼠模型与人类1型糖尿病相似[8]。有研究表明注射50mg/kg的STZ是建立1型糖尿病大鼠模型的最佳选择[9]。（2）2型糖尿病：通过高糖高脂饮食诱导大鼠产生胰岛素抵抗后，再注射STZ损伤其胰岛功能，引起血糖升高，从而模拟2型糖尿病的发展过程进行造模。有研究表明，SD大鼠经过高糖高脂饮食后，质量较正常大鼠增加，胰岛素敏感指数较正常饮食大鼠显著下降，同时空腹血糖、血清总胆固醇、甘油三酯、游离脂肪酸水平较普通饲料组大鼠明显升高增加，这几项指标可以间接反映胰岛素敏感性下降，而有实验表明经过4周高糖高脂饮食可以诱导出较为理想的胰岛素抵抗状态，从而模拟人类2型糖尿病的发病特点[10]。 2.2?SD大鼠?对于STZ诱导的DPN模型大鼠通过上述建模方式可分为自由摄食饮水的大鼠（即与1型糖尿病相似）和高脂饲料喂养的大鼠（即与2型糖尿病相似）。笔者以SD大鼠为代表，通过上述分类方法进行陈述。 2.2.1?自由摄食饮水的大鼠和高脂饲料喂养的大鼠的造模方法及成模标准?自由摄食饮水的大鼠：造模前禁食12 h，按体重腹腔注射给予65 mg/kg 1%STZ（亦有70 mg/kg），自由摄食饮水48～72 h（72 h居多）经尾静脉采血测空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L为造模成功[11-13]。 高脂饲料诱导的大鼠：高脂饲料喂养4周（亦有2周或8周，且8周者居多），禁食12 h，自由饮水，于大鼠腹腔以35 mg/kg（亦有40 mg/kg）单次注射2%的STZ，用药后72 h，于尾尖处取血测空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L即为造模成功[14-18]。 2.2.2?神经功能实验?神经传导速度（nerve conduction velocity，NCV）主要反映神经髓鞘功能，主要代表大的有髓纤維的功能。NCV包括运动神经传导速度（motor nerve conduction velocity，MNCV）和感觉神经传导速度（sensory nerve conduction velocity，SNCV）。MNCV出自α-运动神经纤维，SNCV出自本体感觉Aα纤维。一般大鼠的电生理检查多采用坐骨神经，且本研究检索的文献均采用坐骨神经。坐骨神经为混合神经，包括运动和感觉神经纤维。作为DPN实验研究中最常用的观察指标，MNCV和SNCV分别反映l运动和感觉纤维的功能[4]。 本研究检索的文献均阐述的为下肢NCV的变化，并未有上下肢对比的相关数据的阐述，且沈祥峰等人的研究并未详细阐明部位。数据总结如下： 普通饲料组：莫霏霏[11]研究发现，在造模后1周即出现MNCV的减慢，且有显著差异，并持续到第4周末。焦洋[12]研究发现，在造模后2周开始，MNCV出现显著下降，直到第8周末仍呈下降趋势。沈祥峰[19]等人研究发现，在造模后12周MNCV减慢，且具有统计学意义，并逐渐减慢到第24周。 高脂饲料组：吕翠岩等[15]研究发现，在造模后4周，MNCV开始显著降低，并持续到第16周。王小康[14]研究发现，在造模后8周，MNCV极显著性减慢。SNCV明显减慢。李道卫[17]研究发现，在造模后8周，MNCV明显降低。汪碧澄[18]研究发现，在造模后12周，MNCV明显降低。 2.2.3?行为学实验?行为学实验主要观察的指标为热痛敏和机械痛觉的异常。主要反映了无髓纤维和小的有髓纤维的功能。糖尿病周围神经系统损伤极早期受累的多为无髓及有髓的感觉小纤维和自主神经小纤维，而传统的NCV无法实现对其测定[4]。 2.2.3.1?热痛敏测定实验?大鼠背根神经节中的感觉神经元发出的小神经纤维在疼痛的传递中起作用[11]。热觉受体散布于无髓C纤维，热痛觉较大部分由C类神经纤维传导，同时也波及到Aδ类神经纤维。热痛阈值反映了大鼠对热痛的敏感性，与无髓神经纤维轴突直径正相关[4]。常用的热痛敏测定方法包括甩尾实验和热板实验。甩尾实验通常通过观察甩尾反应潜伏期（Tail Flick Latency，TFL）或摆尾温度阈值作为标准，而热板实验通过观察热缩足反射潜伏期（Thermal Withdrawal Latency，TWL）来衡量。 普通饲料组：莫霏霏[11]研究发现，在造模后1周开始摆尾温度阈值增加，且呈缓慢上升趋势，并持续到第4周末。焦洋[12]研究发现，在造模后2周开始TFL和TWL出现显著缩短，并持续到造模后8周且呈进行性加重。 高脂饲料组：王小康[14]研究发现，在造模后4周，热痛敏反应没有明显变化，8周后明显降低。李道卫[17]研究发现，在造模后8周，摆尾温度阈值明显增高。 2.2.3.2?机械痛觉实验?常用的机械痛觉实验为Von Frey丝实验，其一般通过观察机械痛缩足阈值（Paw Withdrawl Mechanical Threshold，PWMT）来作为标准。 普通饲料组：焦洋[12]研究发现，在造模后2周出现显著降低，并持续到造模后8周且呈进行性加重。 高脂饲料组：汪碧澄[18]研究发现，在造模后12周，PMWT水平明显降低。 通过上述两种实验的数据结果，可以看出小的神经纤维的改变与大的神经纤维的改变并没有明确阐述两者出现的先后顺序。 2.2.4?生物标记物?由于目前DPN的发病机制尚不明确，有多种机制学说，包括代谢毒性、血管性、神经营养因子缺乏、氧化应激等[20]。因此其相关的生物标记物种类繁多，较突出的生物标记物有以下几种类型： 2.2.4.1?氧化应激?氧化应激反应是指机体在遭到有毒刺激时，体内高活性物质生产过多，抗氧化防御機制下降，机体氧化水平超出其对氧化物的清除能力，造成自由基的生成和抗氧化系统之间功能失衡失去平衡，从而引起了自身组织损伤的慢性炎症的过程。周围神经系统的氧化应激是通过刺激细胞内活性氧的生成，使得细胞膜脂质产生过氧化、蛋白质硝化、DNA 退化，引起周围神经系统发生变形、坏死和脱髓鞘样改变。活性氧生产过多或者清除能力下降都会导致氧化应激的发生，它可以诱导神经细胞的损伤[18]。 自由基是表明机体氧化应激的直接指标，但自由基的特点是转瞬即逝，故试验中很难检测。但是部分蛋白质、脂质和DNA自由基损伤的终产物作为表明氧化应激的可靠的间接指标可检测，例如：丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）[8]。 在氧化应激的研究中，谷胱甘肽（Glutathione，GSH）作为还原剂，在生物体内具有重要的抗氧化活性[22]。总抗氧化能力（Total Anti-oxidative capacity，TAOC）主要包括非酶促体系的抗氧化物质和酶促体系某些小分子量抗氧化物质，故TAOC是反映机体抗氧化能力的重要指标之一[21]。 2.2.4.2?炎症因子?外周神经的退行性变化和多种炎性细胞因子密切相关。退行性变化的外周组织可引起以巨噬细胞为主的炎性细胞浸润，进而分泌各种炎性因子如肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor Alpha，TNF-α）、白细胞介素-1（Interleukin-1，IL-1）、单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte Chemoattractant Protein-1，MCP-1）等，蛋白酶如组织蛋白酶和金属基质蛋白酶类（Metal Matrix Proteinase，MMP）及纤溶酶原激活物抑制物表达[14，17]。随着周围环境持续性的高血糖，将会导致核转录因子NF-κB介导作用，炎性因子TNF-α、白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）以及诱导型一氧化氮合酶（Inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS）都能被核因子κB（Nuclear Factor Kappa B，NF-κB）调控且相互间引起神经炎症的恶性循环[14]。NF-κB是一种对氧化还原状态敏感的转录因子，在介导炎症、免疫和凋亡中发挥重要作用。参与炎症反应调节的主要是NF-κB激活的经典通路：氧化应激可导致IKKβ激活，后者可使IκB-α磷酸化、泛素化和降解，分泌出NF-κB p50/p65。NF-κB p50/p65迁移入核，调节炎症因子如IL-6，TNF-α，iNOS，IL-1等的转录，这些物质又能进一步激活NF-κB，这种正反馈机制导致炎症反应不断增加，可加剧组织受损[12]。另外，C反应蛋白（C Reactive Protein，CRP）是一种非特异性炎症性标志物，是一种急性期蛋白，由肝细胞合成。当机体处于炎症情况下，其具有敏感性[23]。 2.2.4.3?神经营养因子?神经营养因子（Neurotrophic Factors，NTF）是一类促进神经元生存、样态发展和生理功能发育的蛋白质，由敏感神经元的靶组织合成。在生理条件下，NTF反向传输至神经元胞体，进行营养的提供，刺激神经递质的表达，促使神经生长作用;在机体外界刺激受损时，NTF的活性增强、合成增加，促进周围神经的修复[18]。常见的神经营养因子包括神经生长因子（Neurotrophic Factors，NGF）、血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）等，各神经营养因子的缺乏显然在DPN的发病过程中具有非常重要的意义[19]。 2.2.4.4?细胞凋亡?DPN的主要表现之一为神经细胞凋亡。细胞凋亡的发生是在多种凋亡基因的调控下进行的。B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、BAX同屬Bcl-2基因家族成员，与凋亡调控关系非常密切，两者之间比例对细胞的凋亡与存活起决定性的作用[24]。另外有研究表明，糖尿病高血糖导致线粒体内膜通透性改变。因此，半胱天冬酶-3（Caspase-3）和半胱天冬酶-8（Caspase-8）在细胞色素c从线粒体基质转运到细胞质后被激活，从而引发神经元凋亡细胞死亡[22]。 2.2.4.5?其他?神经调节蛋白1（Neuregulin1，NRG1）：是生长和分化因子家族，参与外周和中枢神经系统的各种功能，包括受损外周神经再生的基础再生过程。Fricker等人观察到，缺乏NRG1的轴突具有明显较薄的髓鞘[25]。 由于生物标记物的建立大都在处死大鼠后进行的，故部分文献中并未有不同周龄指标结果的比较。 普通饲料组：Erbas O等[22]研究发现，在造模后4周，施万细胞中BAX的表达，Caspase-3和Caspase-8在糖尿病大鼠中均显著增高。而血浆GSH水平显著降低。焦洋[12]研究发现，在造模后8周，坐骨神经中的TNF-α和IL-6程度显著增高，差异有统计学意义。大鼠血清VEGF：莫霏霏[11]研究发现，在造模后1周呈缓慢上升趋势，持续到第4周末。李芊绵等[13]研究发现，在造模后10周，坐骨神经NGF mRNA降低;VEGF mRNA表达明显增高。沈祥峰等[19]研究发现，在造模后12周坐骨神经纤维施万细胞、神经纤维内的血管内皮细胞及轴突中VEGF表达明显增高;坐骨神经组织VEGF mRNA表达显著升高，持续到第24周末。 高脂饲料组：Kelany ME等[26]研究发现，在造模后4周，MDA呈显著性增高;SOD呈显著性降低。王小康[14]研究发现，在造模后8周，TNF-α、IL-6和iNOS表达上有显著性的增多，李道卫[17]研究发现，在造模后8周，血清中 TNF-α、IL-1、MMP-1、MCP-1均显著升高;NGF mRNA表达显著降低。吕翠岩[18]研究发现，在造模后12周，NGF含量水平明显降低;NGF mRNA表达显著降低。Zhou F等[25]研究发现，在造模后7周，NRG1和NGF的表达均显著降低。 2.2.5?神经结构?DPN的结构改变，包括有髓、无髓神经纤维改变和神经内膜的微血管变化[4]。本研究检索的文献均应用HE染色的方法，在光镜或电镜下对坐骨神经进行观察，其他部位的检测，文献中并未阐述。数据总结如下： 普通饲料组：莫霏霏通过将坐骨神经进行在体分离后研究发现，光镜下：正常坐骨神经纤维分布整齐，规则，单个纤维丰满，形态规则，可见半月形施万细胞，髓鞘内轴突清楚，轴索形态正常。在造模后4周其变为排列稀松，可见较多脱髓鞘改变，施万细胞削减，甚至消失，轴突、轴索显著改变。 电镜下：正常坐骨神经髓鞘紧密、板层结构正常、层次清晰。轴突整齐，可见神经微丝、微观分布规则，线粒体结构正常，线粒体嵴稠密，施万细胞细胞膜结构正常。在造模后4周，坐骨神经明显缩小，神经髓鞘改变，髓鞘板层结构消失。轴突内微丝、微管分布杂乱，线粒体外膜尚完整，线粒体嵴削减，甚至消失，施万细胞变性坏死[11]。 高脂饲料组：王小康[14]也将坐骨神经进行在体分离后研究发现，正常坐骨神经排列整齐，髓鞘清楚，组织间密集。在造模后8周，坐骨神经结构排列紊乱，髓鞘脱落，组织间水肿并游离细胞较多。李道卫以相同方法分离坐骨神经后研究发现，光镜下：正常组大鼠坐骨神经有髓纤维分布致密均匀，纤维丰满，髓鞘形态正常，染色均匀;毛细血管形状规则、管壁光滑。在造模后8周，大鼠坐骨神经纤维排列松散紊乱分布稀松杂乱，厚薄不一，出现分离、脱落的现象，可见斑块状密度考减低区;毛细血管管腔不规则、管壁变厚，毛细血管内皮细胞可见肿胀 、变形。 电镜下，正常组大鼠坐骨神经有髓神经纤维的髓鞘紧密均匀。在造模后8周，大鼠坐骨神经有髓神经纤维髓鞘明显变厚，其轴索内基质密集，微丝分布杂乱[17];吕翠岩等[16]运用同上方法进行研究发现，正常组大鼠坐骨神经横切面髓鞘结构正常，施万细胞结构正常，常染色质较多，轴索内可见大量的神经丝、微丝等，且排列规则、结构完整。在造模后16周，大鼠坐骨神经横切面髓鞘的板层结构发生严重改变，各层间分布杂乱，轴索萎缩变细，线粒体嵴锐减，结构杂乱，施万细胞坏死。 2.3?Wistar大鼠 2.3.1?神经功能实验?韩丽萍[4]研究发现，从造模后2周开始MNCV和SNCV明显降低。Yao H等[29]研究发现，在造模后2周MNCV下降，且持续到第8周末。 2.3.2?行为学实验?关于热痛敏测定：韩丽萍[4]研究发现，在造模后2周，热痛缩腿反应潜伏期缩短;持续到第8周末潜伏期仍缩短，表明痛觉过敏作为其早期表现;但在造模12周后出现潜伏期延长，提示后期出现痛觉迟钝。 在对Wistar大鼠相关的实验设计进行整理总结时，发现比较特别的测定内容是Diana Amorim等[27]的冷敏感测定，在造模后4周，出现冷敏感的增加;国内冯程程等[24]也有类似的相关测定，冷缩足实验延长。 关于机械痛阈测定：Rocha IR等[28]研究发现，在造模后2周出现明显下降，并持续到造模后8周呈进行性加重。 2.3.3?生物标记物?实验表明，在造模后8周，MDA含量显著升高、SOD 显著降低[8，21，29，30]，TAOC减弱[21]。还有Rocha IR等[28]研究发现一些异常包括髓鞘内陷、髓鞘致密化紊乱以及糖尿病诱导后30天（近似相当于造模后7周）无髓鞘纤维减少。这些变化在STZ注射后60天内（近似相当于造模后9周）恶化。冯程程等[24]研究发现，在造模后4周，BAX表达增强，Bcl-2表达减弱和Bcl-2/BAX比值显著明显下降，提示Bcl-2、BAX確实在DPN中发挥了关键作用。 2.3.4?神经结构?腓肠神经定量分析：韩丽萍研究发现，造模后2、4周，腓肠神经有髓神经纤维密度未见显著变化，造模后6周有减少趋势，但无统计学意义，从造模后8周开始有统计学意义，且纤维密度呈进行性减少，逐渐表现出神经萎缩。 坐骨神经形态学观察：实验表明光镜下：有髓神经纤维结构正常，施万细胞核清晰，在造模后2、4周时没有显著变化;在造模后6周时神经纤维间距变大，不均匀，可见许多有髓神经纤维发生病变，主要为髓鞘肿胀、变性，轴突缩小，也有某些神经纤维髓鞘脱失，施万细胞增生。在造模后8周、12周神经改变更加显著。 电镜下：在造模后4周内由神经纤维髓鞘具有完整性，板层结构清晰楚，排列整齐，轴突内神经微丝分布较为清晰，变为神经纤维髓鞘脱离，板层结构损坏，可见各层分布杂乱，轴索内部分微丝及微管断损、溶解，轴突变性。在造模后6周、8周、12周，神经改变更加显著，髓鞘板层稀松、断损，排列杂乱，甚至成球状，向轴索面胀大，轴突缩小[4]。 3?自发性糖尿病大鼠相关数据的汇总 笔者以GK大鼠为代表对自发性糖尿病大鼠进行以下数据的汇总： 3.1?神经功能实验?冯露琳等[23，32]研究发现，在造模后12周MNCV、SNCV减慢，MNCV减慢不显著，其降低情况也较SNCV为弱，比较造模后4周、8周，仅在造模后12周差异有统计学意义[31]。 3.2?生物标记物?冯露琳[23]研究发现，在造模后12周，CRP出现明显升高;TNF-α、IL-6也呈现明显升高;胡芸[32]研究发现，Caspase-3：表达水平也上调明显。 3.3?神经结构?富晓旭等[31]研究发现，坐骨神经结构在造模后8周，切片可见部分神经束损害及神经束断损;造模后12周神经束膜均损坏，无完整性，神经纤维细胞核萎缩，神经纤维束断损，发生严重溶解，发生液化性坏死。其间微血管少见，管腔较大，可见巨噬细胞[23，31，32]。 4?讨论 本研究通过总结SD大鼠、Wistar大鼠、自发性糖尿病大鼠不同周龄的DPN的相关指标数据结果发现，关于SD大鼠，普通饲料组除生物标记物外其余三项神经病变相关指标的改变均早于高脂饲料组，而四项神经病变相关指标的对比发现，神经功能的改变可能更早于行为学的改变，而生物标记物的研究由于该项的检测大都在大鼠处死后进行，故无法准确的进行对比，另外神经结构的改变可能晚于前两项。关于Wistar大鼠，神经功能与行为学的改变可能差异不大，而神经结构的改变仍晚于前两项。关于自发性糖尿病大鼠，其行为学没有发现特征性数据的总结，且MNCV和SNCV相比于SD大鼠、Wistar大鼠敏感性较低;对于人类而言，SNCV会先于MNCV而变化，韩丽萍的研究表明，SNCV相比于MNCV改变出现得较早且改变明显，有时甚至作为仅有的改变[4]。而结合所整理的大鼠相关数据，除自发性糖尿病大鼠，均并未详细阐述两者的差异。在实验成本方面相对于其他两类大鼠更昂贵，故在实验应用上SD大鼠和Wistar大鼠更广泛。 SD大鼠与Wistar大鼠之间通过 本次的数据总结也可以发现，SD大鼠的神经功能与神经结构的改变可能比Wistar大鼠更早，当然对于糖尿病大鼠不同周龄的探讨也发现，造模后1-4周，实验的结果可能会有差异，但是造模后8周的实验结果，差异性基本较小。而造模后12周的实验结果可能会与造模后2周、4周、6周、8周的结果有所不同，故建议实验的周期尽量在12周左右，如此对于数据的把握更具说服力。 当然本次对实验结果的探讨也有一定的局限性，如SD大鼠的普通饲料组与高脂饲料组所注射的STZ剂量及浓度有所不同，可能会对相关数据有所影响。而另一方面，由于Wistar大鼠特征性的相关研究较少，为了更全面的阐述相关数据，本文也参考了较早的论文，2007年韩丽萍[4]的硕士学位论文，而针对实验本身，由于各个实验设计的实验基础要求的不同，例如糖尿病大鼠模型取材部位、建模所需时间、大鼠模型摆尾温度的要求等，糖尿病周围神经病变大鼠模型的相关数据结果可能会产生差异，但是从所收集的总体数据可以发现，SD大鼠比Wistar大鼠更敏感，更适合作为DPN模型大鼠用于实验研究，且SD大鼠应用于1型糖尿病组比2型糖尿病组更敏感。 参考文献： [1]中国2型糖尿病防治指南（2017年版）[J].中国实用内科杂志，2018（4）：292-344. 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