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肌酸激酶在杜氏肌营养不良症新生儿筛查中的应用研究

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许佳牟凯李雨雨李洪俞宋海波

摘要：目的将肌酸激酶MM同工酶（ CK-MM）用于新生儿杜氏肌营养不良症（DMD）筛查，为该病在鲁中地区防治提供及时可靠的诊断依据。方法收集男性新生儿滤纸干血片样本10 376份，采用时间分辨荧光法检测CK-MM，统计分析CK-MM值并设定需要进行基因检测的临界值，对筛查阳性的样本进行DMD基因检测。结果时间分辨荧光法检测CK-MM的批内CV、批间CV和平均偏移均<10%，DMD患儿CK-MM浓度临界值可设为700ng/mL。结论以滤纸干血片为样本检测CK-MM筛查DMD患儿有区域差异，但检测方法简便，值得临床推广。

关键词：杜氏肌营养不良症;肌酸激酶同工酶;新生儿筛查;滤纸干血片

【中图分类号】R272.1 【文献标识码】A 【文章编号】1673-9026（2021）03-049-02

假性肥大型进行性肌营养不良症包括杜氏肌营养不良和贝克氏肌营养不良两种临床类型，二者是等位基因异质性疾病，发病率分别为活产男婴的1/3，500和1/30，000[1]，其中杜氏肌营养不良症是肌

营养不良中最常见和最严重的类型，由于基因突变影响dystrophin蛋白在横纹肌组织的表达，导致肢体近端骨骼肌进行性萎缩，无力和腓肠肌假性肥大，典型表现为运动发育迟缓，甚至倒退、特殊的“鸭步”步态，血清肌酸磷酸激酶（CK）活性升高，心肌细胞损伤。在DMD的情况下，早期使用皮质类固醇进行干预，在许多国家，包括中国，经常延迟和不经常使用皮质类固醇，延长了行走时间，提高了生活质量[1，2]。此外，对7岁以上的男孩进行的研究性遗传治疗（例如，外显子跳过）正在进行第3阶段临床试验，该阶段的临床试验中使用了outcom。因此，新生儿筛查（NBS）对那些在生命早期就有资格接受这些治疗的患者进行鉴别是非常重要的。2012年，Mendell等人[3]报告了DMD-NBS的一种新的两步方法，在新生儿干燥血斑上检测肌酸磷酸激酶（CK），然后在CK升高的样本上直接检测DMD基因。这种方法为中国等国家提供了一个利用CK标记物诊断DMD患者的机会。2019年7月，淄博市妇幼保健院在山东范围内率先启用美国PE公司的全自动免疫荧光分析仪（GSP）和全自动打孔仪Panthera-Puncher 9系统，实现DMD项目打孔检测自动化，在山东省范围内率先使用GSP开展新生儿男婴的CK-MM的科研检测项目。截止到2020年2月，我院共完成CK-MM检测10376人次。

本文通过对在GSP上完成CK-MM筛查的10376人次数据进行分析，使用百分位数法和应试者操作特征曲线（ROC）研究在GSP上DMD筛查的最佳CK-MM切值点。

1材料与方法

1.1研究材料

2019年7月-2020年1月全市范围内出生的活产男性新生儿10376例。新生儿在出生72小时后且7天内，并经充分哺乳6次以上，采集新生儿足跟血滴于S&S903滤纸上，自然干燥后于2-8℃冷藏，7天内送达淄博市妇幼保健院新生儿疾病筛查中心实验室，标本送达后5天内完成检测。

1.2检测仪器与方法

采用全自动打孔仪Panthera-Puncher 9打血班，在PE公司的GSP上上机检测;试剂为PE公司GSP配套CK-MM项目检测试剂盒，采用时间分辨免疫荧光法（DELFIA）。

1.3实验室质量控制

检测板为标准 96 孔微孔板，每板均設三个浓度的质控品做为质控物，每个质控品测定一次。本新生儿疾病筛查中心实验室接受国家卫生部临床检验中心新生儿疾病筛查实验室室间质量评价，DMD项目作为调查项目，结果合格，室内质控结果统计如下：

1.4切值建立方法

使用IBM SPSS Statistics 21.0软件运用百分位数法和ROC曲线法进行统计学分析。

2结果

2.1自2019年 7月至 2020 年2月，10376例男性新生儿CK-MM浓度呈偏态分布，其中有 5例CK-MM≥650ng/mL，占0.048%。经重采血复查后，仍有1例CK-MM≥700ng/mL。

2.2 10376例新生儿样本，其CK-MM初筛样本基本情况见表2，其样本浓度频率分布见表3。CK-MM分布在9.1-1807.2 ng/mL，其中CK-MM浓度在新生儿中数的分布呈对数正态分布，具有较高的置信度（P<0.005）。观察到中位数测量的CK-MM浓度随着年龄的增长而逐渐降低，如表4。

2.3 两次筛查结果CK-MM≥700ng/mL的患儿经MLPA方法排除DMD基因突变，家属拒绝进一步的神经肌肉疾病的诊断检查。

3讨论：

DMD是X连锁隐性遗传病，主要表现为进行性对称性骨骼肌无力和萎缩，至今无治愈手段，通常男性发病。患儿出生时常无症状，发病隐匿，大部分患儿坐、立时间发育正常。DMD患儿首先出现的症状多为行走缓慢，随后出现四肢近端、躯干和骨盆带肌肉无力、肌张力低，蹲起和上楼困难，因盆带肌无力走路时腰椎前突并呈典型鸭步步态。DMD突变基因女性携带者90%以上为表型正常，仅表现为血清肌酶轻到中度升高，少数可有DMD症状。发病年龄也由幼年到成年后的40或50岁，临床表现可轻重不等，从一般的肌痛、痉挛到严重的肌无力均可出现，一小部分合并扩张型心肌病。淄博市2019年7月-2020年1月期间出生的男性婴儿中未发现DMD患儿，这与王燕敏等[4]、杨小二等[5]报道有差异，新生儿DMD的发生存在地区差异。本研究由于局限于短期数据，尚不足以代表淄博地区整体的新生儿DMD发病情况，研究结论还有待于进一步收集验证。

CK一直是DMD诊断的重要指标，但CK浓度易受年龄、性别、种族、地域、运动状态、疾病等多种因素的影响，且如何界定CK检测值与DMD之间的关系尚无明确标准[6]。CK-MM是CK在骨骼肌中存在的主要同工酶形式，CK-MM作为骨骼肌损伤的指标比CK更具特异性。而切值是筛查工作中诊断和治疗的重要依据，筛查切值是否准确直接影响筛查实验室的工作质量，太高会引起漏诊，太低会引起人力、物力的浪费。国内暂未形成新生儿DMD筛查标准，DMD阳性切值的合理设定是DMD筛查的关键同时也是难点，尤其是早产儿或低体重儿对切值是否像CAH筛查一样存在显著影响，使DMD筛查面临极大的挑战[7]。

Dystrophin蛋白有多种亚型，表达的部位不尽相同，且各自拥有不同的启动子，不同类型DMD基因突变可以决定患者的表型特征。Dystrophin蛋白在多个组织和器官中行使重要功能，所以DMD可累及多个系统。随着患儿年龄的增长，肌无力、呼吸功能不全、肌肉骨骼畸形以及心肌受累的程度均会逐渐加重。此外，DMD患者多合并认知功能障碍、自闭症谱系障碍和行为问题，但这些合并症在疾病病程发展过程中进展不明显。

参考文献

[1]Mendell JR，Shilling C，Leslie ND，et al.Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy [J]，2012，71：304-313

[2]Bushby K，Finkel R，Birnkrant DJ，et al.Diagnosis and management of Duchenne muscular dystrophy，part 2：implementation of multidisciplinary care[J].Lancet Neurol，2010，9：177-189.

[3]Mendell JR，Shilling C，Leslie ND，Flanigan KM，al-Dahhak R，Gastier-Foster J，et al.Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy.Ann Neurol 2012;71：304-313.

[4]王燕敏，田國力，纪伟，张潇分.肌酸激酶MM同工酶在新生儿杜氏肌营养不良症筛查中的应用[J].检验医学，2020，35（11）：1115-1119.

[5]杨小二，俞菁，胡荷宇，章莉，孙黎，龚波.肌酸磷酸激酶检测联合分子诊断技术筛查新生儿杜氏肌营养不良症[J].中华检验医学杂志，2015，38（01）：32-34.

[6]柯青，张利.Duchenne型肌营养不良症自然病程演变规律 [J].中国现代神经疾病杂志，2015，15（5）：355-359.

[7]杨茹莱.杜氏肌营养不良临床特点及诊治进展[J].中国儿童保健杂志，2018，26（03）：233-235.

本课题受1、山东省医药卫生科技发展计划资助，项目编号为2016WS0740、2017WS044;2、受国家重点研发计划资助，项目编号2018YFC0114703。

淄博市妇幼保健院 255000

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