| 标题 | 基于表面增强拉曼光谱的酪氨酸酶可抛式传感器研究 |
| 范文 | 甘振飞 汪璐 郭丹 李大伟 摘 要 研制了一种可抛式表面增强拉曼光谱（SERS）传感器用于检测血清中酪氨酸酶（TYR）活性。首先制备了功能化银纳米颗粒浆料，采用丝网印刷技术制备SERS传感器。修饰在传感器上的4-巯基邻苯二酚可被酪氨酸酶催化氧化為4-巯基邻苯二醌，引起传感器SERS光谱的显著变化，从而实现对酪氨酸酶的检测。此传感器对酪氨酸酶响应快速，在优化条件下5 min内即可完成检测; 特征SERS信号强度与酪氨酸酶浓度在1～100 U/mL范围内呈良好的线性关系，检出限为0.28 U/mL（3σ）。由于检测反应的特异性和SERS技术可提供指纹信息的综合优势，此传感器有较好的抗干扰性能。血清样品中的加标回收率为88.1%～104.6%，相对标准偏差（RSD）小于4%，可准确反映苯甲酸的含量及其对酪氨酸酶的抑制能力。结果表明，所研制的可抛式SERS传感器可一次性使用，适合生物样品中酪氨酸酶的快速分析，以及酪氨酸酶抑制剂的快速筛选和检测。 关键词 表面增强拉曼光谱; 酪氨酸酶; 传感器; 可抛式 1 引 言 酪氨酸酶（TYR）作为一种重要的氧化还原酶，可将邻苯二酚类物质催化氧化为邻苯二醌类化合物，参与人体内黑色素的合成[1]。研究表明，人体血清中酪氨酸酶活性正常水平约为6.5～9.5 U/mL[2]， 酪氨酸酶不足会导致白癜风[3]; 过表达时，则可引起雀斑[4]和帕金森氏综合征[5]，是黑色素瘤的标志物之一[6]。因此检测生物样本中的酪氨酸酶具有重要的临床意义[7]。目前，用于检测酪氨酸酶的方法主要有比色法[8]、电化学法[9]和荧光法[10～13]等，这些方法或操作简便、或灵敏度较高，但在酪氨酸酶活性实际检测中也面临着一些挑战，如特异性不强、受光漂白或光毒性影响等[14～17]。 表面增强拉曼光谱（SERS）能提供分子指纹信息，具有灵敏度高、检测快速等优势[18～20]。SERS技术已被用于蛋白等生物分子的检测分析，但由于蛋白分子较为复杂，SERS谱图的解析较为困难，使其直接检测受到限制[21]。而基于化学反应的SERS传感策略则有望克服此类问题，该策略将具有SERS活性和与待测物反应的性能集于传感器或探针，可产生灵敏清晰的SERS信号，只需要观察传感器或探针与目标检测物反应前后产生的光谱变化即可实现检测[22]。Li等[23]基于叠氮化合物与硫化氢的特异性反应，研制了新型高灵敏特异性SERS纳米传感器，实现了单细胞中硫化氢气体信号分子的原位监测。 丝网印刷技术具有印制过程均匀可控，以及网印产品重现性好、小巧便携、费用低廉等优点[24]。Qu等[25]利用丝网印刷技术批量制备出稳定性好、重现性高，且易于保存携带的可抛式SERS传感器，对罗丹明6G的检测灵敏度可达1013 mol/L，并且方便大批量样品检测中一次性使用，避免交叉污染。但血清中酪氨酸酶的丝网印刷SERS传感器研究尚未见报道。 本研究结合SERS和丝网印刷传感器的优势，制备了一种用于检测酪氨酸酶的可抛式SERS传感器，优化了检测条件，为血清中酪氨酸酶检测和酪氨酸酶抑制剂筛选提供了灵敏快捷的分析方法。 2 实验部分 2.1 仪器和试剂 USB2000紫外-可见光谱仪（美国Ocean Optics 公司）; Ultra 55扫描电子显微镜（德国Carl Zeiss公司）; JEM-2100高分辨透射电子显微镜（日本JEOL公司）; BWS415便携式激光拉曼光谱仪（美国B&W Tek公司）; AT-259A丝网印刷机（东远精技工业有限公司）。 AgNO3（99%）、柠檬酸三钠（≥99%）、KCl（≥99%）、羧甲基纤维素钠（CMC，Mw=70000，粘度≥1200 mPas）和酪氨酸酶（≥1，000 U/mg）购于Sigma-Aldrich公司; 谷胱甘肽（GSH， 95%）、尿素（99%）和NaCl（≥99.5%）购于阿拉丁试剂有限公司。Gibco 胎牛血清购于Thermo Fisher 公司。NaClO（99.7%）和H2O2（30 %）购于上海凌峰化学试剂有限公司。实验用水为去离子水（18 MΩ cm）。 2.2 实验方法 2.2.1 4-巯基邻苯二酚的合成 在氮气保护下，将0.85 g 3，4-二甲氧基苯基甲硫醇冰浴冷却至 10℃; 加入2.50 g BBr3，反应12 h; 然后分离有机相，干燥，提纯得到4-巯基邻苯二酚[26]。质谱表征显示， 合成物在m/z 142.0090处有一个强峰，与4-巯基邻苯二酚相吻合。 2.2.2 丝网印刷浆料的制备 按照文献[27]方法制备银纳米颗粒，制备好的银胶于4℃保存。制备丝网印刷银浆时，在银纳米颗粒上修饰4-巯基邻苯二酚， 6500 r/min离心5 min，移除99%上层清液，与4.0%羧甲基纤维素钠（CMC）按照3∶1（V/V）混合，制得丝网印刷浆料。 2.2.3 酪氨酸酶传感器的制备 依据设计的阵列网板，参考文献[25]中的方法，在纸质基体上利用丝网印刷机分层印刷碳浆和4-巯基邻苯二酚功能化的银纳米颗粒浆料，印制SERS传感器阵列。主要印制过程为：将纸质基体与阵列网板分别固定于丝网印刷机的相应位置并将印刷浆料放置于网板一端，利用刮刀挤压浆料透过阵列图形区域，然后将印制好的传感器阵列从丝网印刷机中取出烘干，保存。 2.2.4 酪氨酸酶的检测 酪氨酸酶用K2HPO4-KH2PO4缓冲液（50 mmol/L， pH=5.6）溶解，分装后，于 20℃避光储存，使用时取出，在37℃融解。将酪氨酸酶溶液（25 kU/mL）梯度稀释，加入到1 mL K2HPO4-KH2PO4缓冲液（10 mmol/L， pH=7.4）中，获得不同浓度的酪氨酸酶溶液。将SERS传感器插入溶液，于37℃孵育5 min，取出传感器，采集拉曼光谱。血清加标回收实验采用相似步骤完成检测。 3 结果与讨论 3.1 检测原理 通过在银纳米颗粒上修饰新合成的4-巯基邻苯二酚，并将其印刷到已印有碳层的纸质基体上，制备可抛型酪氨酸酶SERS传感器。如图1所示，在氧气存在下，酪氨酸酶可将传感器上的4-巯基邻苯二酚的羟基催化氧化为羰基，导致传感器的SERS光谱发生变化，并产生新的SERS谱峰。基于这一特征性SERS光谱信号，可实现对生物样品中酪氨酸酶的检测分析。 3.2 传感器表征 所制备的SERS传感器阵列有10×4个传感点位，每个传感点位约为28 mm2，可裁剪为单个可抛式传感器，独立完成便携检测（图2A）。扫描电镜表征显示（图2B），传感器上的银纳米颗粒为球形，直径约50 nm，且粒径分布均匀，具有较好的SERS增强活性[28]。进一步考察发现，传感器与酪氨酸酶孵育后，SERS光谱发生明显变化，在484 cm1处出现新的信号峰（图2C）。通过密度泛函理论计算可知，484 cm1处谱峰主要来自于CO振动，而784、898和1071cm1处谱峰归因于COH与CCC的振动叠加。如前所述，这是由于酪氨酸酶催化氧化作用所致，表明传感器对酪氨酸酶有优良的SERS响应能力。此外，传感器制备的重现性考察实验表明，随机选取10个传感点位的SERS谱图基本一致（图3A），并且在1071 cm1处代表性谱峰强度的相对标准偏差在10%以内（图3B），重现性良好。 3.3 检测条件的优化 优化了孵育pH值、温度和时间等酪氨酸酶的检测条件。由图4A和图4B可知，pH值从5.0增长到7.4时，表面增强拉曼光谱中拉曼位移484 cm 1处的峰强度（I484）随之增强，pH值>7.4时，I484减弱; 检测温度在37℃、pH=7.4时，I484最强; 这可能是由于此时酪氨酸酶活性最大[29]，因此更适合传感器检测。由图4C可见，I484随孵育时间延长而增强，时间超过5 min后，I484基本保持不变，表明酪氨酸酶催化反应达到平衡，所以选择酪氨酸酶的检测时间为5 min。即本传感器可以在5 min内完成检测，实现对酪氨酸的快速分析[30～32]。 3.4 抗干扰性 3.5 传感器分析性能 3.6 血清样品分析 为评估所研制的传感器分析生物樣品中酪氨酸酶的可行性，对胎牛血清（FBS）中TYR进行了检测。如表2所示，4个加标水平下，酪氨酸酶的回收率在88.1%～104.6%之间，相对标准偏差（RSD）在0.5%～3.4%之间，良好的检测性能可能是由于酶催化反应的专一性和SERS传感器的高重现性和选择性，表明所研制传感器可用于血清样品中酪氨酸酶的检测。 3.7 TYR抑制剂的筛选和评估 4 结 论 合成了4-巯基邻苯二酚功能化银纳米颗粒浆料，采用丝网印刷技术制备了可抛式SERS传感器，用于检测TYR。此传感器重现性高，SERS信号相对标准偏差小于10%; 在优化条件下，5 min内即可完成TYR的快速检测; 传感器制备和检测方法简单，抗干扰能力强，对TYR的检出限低于0.3 U/mL，血清样品中加标回收率为88.1%～104.6%。此传感器在酪氨酸酶活性分析及其抑制剂筛选检测相关生物医学领域中具有良好的应用潜力。 References 1 Ramsden C A， Riley P A. 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