| 标题 | 以松材线虫为靶标生物防治技术研究 |
| 范文 | 徐红梅 赵青 殷涛 摘 要： 松材线虫病是林业上一种毁灭性病害，在中国仍呈蔓延趋势。松材线虫病生物防治研究的目标可以是媒介昆虫（松墨天牛），也可以是松材线虫。本文综述了以松材线虫为靶标的生物防治技术研究进展。 关键词： 松材线虫病；松材线虫；生物防治 中图分类号：S763.16 文献标识码：A 文章编号：1004-3020（2018）01-0051-05 Advances in Biological Control Targeting on Bursaphelenchus xylophilus Xu Hongmei（1） Zhao Qing（2） Yin Tao（2） （1.Hubei Academy of Forestry Wuhan 430075；2.Hubei Forest Pest Control and Quarantine Station Wuhan 430079） Abstract： As a destructive disease ， pine wilt disease remained propagating trend in China.Biological control could target on insect vector（Monschamus alternatus） or pathogenic nematodes （B.xylophilus）.Advances in biological control targeting on B.xylophilus was reviewed in this paper. Key words： Pine wilt disease；B.xylophilus；biological control 松材线虫病是林业上一种毁灭性病害，属国际重要检疫对象，主要分布于美国、加拿大、墨西哥、日本、中国、韩国、朝鲜、法国、尼日利亚和葡萄牙等多个国家。目前，中国松材线虫病仍呈发展蔓延趋势，直接经济损失数亿元[1]。 国内外一直重视松材线虫病防治技术研究，并提出了许多有效的防治措施，主要有营林技术、物理防治、化学防治几大类。总体说来，松材线虫病的防治仍然面临着诸多困难。例如，防治成本高，部分地区松材线虫防治经费甚至高于松树经济价值；大量使用化学药剂易产生3“R”问题，即残留（residue）、抗性（resisitance）、再猖獗（resurgence），尤其是杀线药剂毒性很强，隐患多。近年来，人们注重利用具有杀线活性的动物、植物、微生物对松材线虫病开展生物防治研究。 松材线虫由媒介昆虫—松墨天牛从患病木中携带而出，松墨天牛补充营养或产卵时侵染到健康树中。松材线虫（病原线虫）、松墨天牛（传播媒介）和松树（寄主）三者之间的生物学联系构成了松材线虫病的侵染循环。松材线虫病生物防治的目标可以是传播媒介松墨天牛，也可以是松材线虫（或其携带的致病细菌）。目前有关松墨天牛的生物防治研究和利用报道较多，直接以松材线虫或其携带的致病细菌为靶标的生物防治研究相对薄弱。 1 松材线虫生防真菌 对于松材线虫具有生防潜力真菌可分为捕食真菌、内寄生真菌和产毒真菌几大类。 1.1 捕食松材线虫真菌 捕食线虫真菌是自然界中广为分布的线虫天敌，能产生捕食器官捕食线虫。捕食性真菌捕捉线虫的方式一是收缩环捕捉器套住松材线虫，从而杀死线虫并在虫体内繁殖；另一方式是三维菌网粘缠线虫，从而致死线虫，吸收其营养并在其体内繁殖。 Saiki等从松树汁液中分离到一种捕食性真菌-节丛孢属真菌（Arthrobotrys sp.），对松材线虫病具有防治效果[2]。莫明和等研究表明，指状节丛孢（A.dactyloide）的3个菌株对松材线虫和拟松材线虫均表现出较高的捕食率，接种7 d后对松材线虫和拟松材线虫的捕食率分别达到了98.08%，91.16%，86.30%和96.28%，90.45%，85.38%[3]。鄢小宁等从海南橡胶根围土壤分离到了一株少孢节丛孢（A.oligospora）真菌，该菌对松材线虫捕食作用较强，在CMA培养基上捕食率最高[4]。Wang等对2个Drechslerella dactyloides菌株研究表明，2个菌株对松材线虫均具有很高的捕食能力，其中一个菌株接种24 h后捕捉力可达100%[5]。 1.2 内寄生真菌 Esteya vermicola是首例报道的松材线虫内寄生真菌，其新月形孢子能黏附在线虫虫体上诱导其感染。Wang等从森林土壤中感病的线虫体内分离出多个E.vermicola新菌株，生测表明其中一个菌株在4～5 d内就能感染致死几乎全部供试松材线虫，温室试验和2年林间试验表明接种的真菌能在松树内生长并感染松材线虫，证明该菌具有较大生防潜力[6]。 除此之外，Harposporium sp.是目前已发现的另一种松材线虫内寄生真菌，其孢子能附着在松材线虫体表，孢子萌发时侵入虫体内繁殖并杀死线虫[7]。 1.3 产毒真菌 自从上世纪60年代Olthof提出真菌次生代谢产物毒杀线虫理论以来，从产毒真菌中筛选杀线活性物已成为研究热点。董锦艳等记载，1997年以前共发现90余种杀线真菌毒素，来源于50多株杀线虫真菌，分布在担子菌、子囊菌和半知菌。测试线虫大部分为腐生线虫（Caenorhabditis elegans）、根结线虫和胞囊线虫（Heterodera spp），对于松材线虫有毒杀活性的代谢物较少[8]。 Kawazu等从真菌菌株D1084中分离到两种杀线成分，命名为bursaphelocides A和B，100μg的毒素A和B对松材线虫有活性[9]。孙建华等从土壤真菌中筛选出有极强抗松材线虫活性的总状共头酶（Syncephalastrum racemosum），与松材线虫一起培养48 h后松材线虫全部死亡。该菌株（Sr18）活性成分为该菌的代谢产物，是一种水溶性的中性物质，具极强的杀线活性[10-11]。董锦艳等报道日本亮耳菌（Lampteromyces japonicus）对松材线虫有毒杀活性。供试菌株为采自贵州的日本亮耳菌野生型菌株、驯化型菌株和由野生型菌株继代培养出的退化型菌株，其中退化型菌株对松材线虫毒杀活性最高 [12]。向红琼等檢测了糙皮侧耳（Pleurotus ostreaus）液体培养菌丝体粗提毒素对松材线虫的毒杀活性，发现丙酮粗提毒素活性极强，一倍稀释液15～20 min对松材线虫击倒率为100%[13]。 张建平等发现糙皮侧耳、香菇（Lentinus edodes）、黑木耳（Auricularia auricula）、拟管革裥菌（Lenzites trabea）、粘褶菌（Gloeophyllum trabeum）、洁丽香菇（Lentinus lepideus）、杂色云芝（Polyporus versicolor）等7株木腐菌都对松材线虫具有一定的抑杀作用，松材线虫在粘褶菌和糙皮侧耳菌落上完全不能存活[14]。Dong和Zhu等研究表明，近160株淡水真菌供试菌株中黑团孢属（Periconia）、核孢壳属（Caryospora）、透孢黑团壳属（Massarina）、拟壳二孢（Pseudohalonectria）、黑孢壳属（Melanospora）、长棒孢属（Camposporium）、蛇孢球壳属（Ophioceras）等属的大部分菌株培养滤液或菌丝粗提物对松材线虫有毒杀活性，并从1个菌株培养物的粗提物中纯化出4个具有杀线活性化合物[15-16]。 李国红等报道了一种杀线虫侧耳属担子菌（Pleurotus sp.），在12 h内松材线虫的致病率达90%以上，其活性组分不需要诱导可稳定生成，水溶性[17]。Dong等研究了181株担子菌对松材线虫的毒杀活性，其中26株真菌菌丝培养滤液具有杀线活性[18]。Liu等对40株青霉（Paecilomyces sp.）真菌的甲醇提取物进行了杀线活性测定，结果发现11株对松材线虫有杀线活性，并从其中一个菌株的提取物中分离纯化出一种新的杀线化合物[19]。 综上所述，对松材线虫具有毒杀潜力真菌资源较为丰富，已有一定研究基础并具有开发应用前景，但大部分研究停留在菌株筛选及活性物质粗提层面，未深入到相关毒素组分与结构研究。 2 松材线虫生防细菌 细菌较真菌生长快，易培养，应用细菌防治植物寄生线虫研究已取得较大进步，并且有许多成功应用实例。如寄生性细菌Pasteuria penentrans已被成功地用于防治根结线虫。 2.1 杀线细菌 有关松材线虫生防细菌活性菌株分离和筛选研究也逐渐增多。Zheng等对206株植物内生细菌进行了杀线活性测试，其中92株细菌对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）有杀线活性，70株细菌对松材线虫有杀线活性，其中一个缺陷短波单胞菌（Brevundimonas diminuta）菌株LCB-3对两种线虫杀线活性最强，并从其培养上清液中分离到一个具有杀线活性化合物[20]。朱丽梅等从马尾松上分离到的300多株菌株中筛选出一株对松材线虫具有较高毒性的拮抗细菌JK-JS3，并鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）[21]。牛秋红等从农田植物根部土壤中分离获得了198株细菌，经过毒性测试筛选出松材线虫生防细菌6株，Bacillus sp. NS-3菌株对松材线虫的杀灭活性最高，该细菌液体培养上清液和上清蛋白粗提物处理松材线虫48 h后线虫的死亡率分别达到50%和100%[22]。罗兰等从51株苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）菌株中筛选出2个菌株，研究表明其对松材线虫的致死率分别大于50%和75%[23]。其它的芽孢杆菌也陆续被发现具有杀线活性，如侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus lateosporus）的多个菌株对松材线虫都表现出较强毒杀作用。 2.2 新型生防细菌 在美国、加拿大和墨西哥，松材线虫病并未对松林造成严重危害，而在中国、日本和韩国，松树线虫病引起松树的大量死亡，给国民经济和生态系统造成严重损失。这一现象引起了许多专家学者的注意。美国是松材线虫病的发源地，如今松材线虫病在美国并不严重，很可能是美国的松材线虫致病性较弱。依据松材线虫多种病原复合致病学观点，松材线虫虫株致病性弱的原因不是松材线虫本身，而很可能是线虫体表携带的细菌不同。学者推测，可能美国松材线虫所携带的细菌经过了长期的演替已发展到一个高级阶段，美国松材线虫所携带的细菌致病性弱，对环境的适应性强。如果能分离筛选出致病性弱适应性强的细菌，释放到中国松林，来替代松材线虫体表致病性强的细菌，将有望改变松林微生态环境，有助于解决松材线虫病的防治问题。 南京林业大学森林病理实验室从美国松材线虫体表分离筛选到一株嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomnas maltophilia）Smal-007，该菌有致病力弱、定殖和替代能力强、对环境安全无毒等特点，具有防治松材线虫病的潜能[24-26]。该项成果和专利技术已经在安徽、福建等地推广应用，结果表明在松林中喷洒Smal-007菌株发酵液后，林间松树枯死率下降明显，对松材线虫病的防治效果在90%以上，对松材线虫病的控制效果理想。 3 植物毒素及杀线活性 植物在长期与昆虫协同进化过程中，产生了许多种具有杀虫活性的次生代谢产物。根据文献记载，具有杀线虫活性的植物约有102科226属316种，研究较多的有菊科、楝科、豆科、十字花科、茄科、禾本科、大戟科、罂粟科、夹竹桃科、含羞草科、百合科等[27]。 随着人们对松材线虫研究的深入，许多种植物的提取物对松材线虫的毒杀潜力已经得到很好的评价和印证。Kawazu等最先使用棉球实验法测定了31科61种陆地植物对松材线虫的毒杀活性，在剂量为每球20 mg时，菊科植物菌陈蒿（Artemisia capillaris）、大蓟（Cirsium japonicum）、剑叶金鸡菊（Coreopsis lanceolata）、一年蓬（Erigeron annuus），蔷薇科植物华东山樱（Prunus verecunda）、地榆（Sanguisorba officinalis），五加科植物树参 （Dendropanax trifidius），及大戟科植物油桐（Aleurites fordii）、日本油桐（A.cordata）、白木烏桕（Sapium japonicum）、乌桕（Triadica sebifera）等4科的11种植物的甲醇粗提物对松材线虫表现出毒杀活性[28]。 Matsuda等报道豆科植物苦参（Sophora flavescens）根部的甲醇提取物对松材线虫具有很强的毒杀作用，其活性成分被证实为N-甲基野靛碱和臭豆碱。从苦参的地上部分分离到苦参碱杀线虫活性很弱，槐果碱和槐胺碱具有较强的杀线虫活性，槐果碱的活性又高于槐胺碱[29]。 Muhammad等使用棉球实验法测定了马来群岛以民间药用植物和传统食用蔬菜为主的42科79种植物甲醇粗提物对松材线虫的毒杀活性。在剂量为每球20 mg时有19科27种植物的粗提物表现出对松材线虫的毒杀活性。姜科8种植物对松材线虫都不具有毒杀能力，故推断姜科植物不含杀线虫活性物质。Muhammad发现胡椒科植物胡椒 （Piper nigrum）、蒌叶（Piper betle）对松材线虫具有很好的毒杀作用，研究表明胡椒科植物的有效成分是丙烯基酚类化合物[30]。 赵博光对野生灌木苦豆子（Sophora alopecuroides）中提取的苦豆碱的研究表明，使用含苦豆碱的培养基培养松材线虫5 d后对线虫的半致死量为0.026 3 mg/ml；浓度为0.1 mg/ml、0.026 3 mg/ml时，药后15d对线虫的致病率分99.9%和94.3%。经林间试验证实，用苦豆碱小面积治疗感病黑松，防治效果明显，同时还发现苦豆碱制剂具有内吸性，对松材线虫病有良好的预防作用，该成果已申请国家专利。在实验的基础上，提出了官能团对（FGP）的概念，提出了双稠哌啶类型生物碱分子结构与杀线虫活性间的关系的假说，比较圆满地解释了N-甲基金雀花碱、臭豆碱、苦参碱、槐果碱、槐胺碱、苦豆碱、金雀花碱、鹰爪豆碱等8种生物碱的结构与其杀线虫活性间的关系[31-34]。文艳华等报道毛鱼藤（Derris elliptica）根对松材线虫有极强杀线虫活性，经该抽提物处理后，松材线虫的增殖比率小于10%；三尖杉（Cephalotaxus fortunei）茎叶、粗榧（Cephalotaxus sinensis）叶、白刺花（Sophora viciifolia）种子、紫斑牡丹（Paeonia suffruticosa）茎有强杀线活性，松材线虫的增值比率为10%～25%；野菊（Dendranthema indicum）全株有中等杀线虫活性，松材线虫的增殖比率为25%～40%[35]。 巨云为等用苦楝（Melia azedarach）树皮和果实的乙醇提取物对松材线虫进行生物活性试验，发现两种提取物在100μg/g时对松材线虫皆具很强的致死作用，其中树皮提取物的杀线虫效果稍优于果实提取物[36]。 由此可见，植物中针对松材线虫天然毒素很多。除了苦豆碱、金雀花碱、鹰爪豆碱、槐果碱、槐胺碱、苦参碱、甲基野靛碱、臭豆碱、野靛碱等生物碱的化学结构与作用机制做了较为深入研究外，其它活性成分种类和结构未做具体研究。从杀线植物中分离提取天然杀线活性物质，并以这些物质为模板进行人工合成，筛选出高效、经济、安全的线虫控制剂研究已成为一个重要研究方向。 4 讨论 全球农业线虫生防领域，第一代商品制剂由于活菌剂容易受到土壤抑菌作用和环境因素影响，常常出现施用效果不稳定现象，因此人们更加关注第二代产品开发，即菌株次生代谢产物的研究与开发，目前第二代产品开发多停留于实验室研究阶段。 对一种供试线虫毒力高的菌株（或代谢物），对另一种供试线虫不一定具备高毒力。因此，以松材线虫为靶标的生物防治研究应采用松材线虫为测试线虫来衡量供筛选菌株或代谢物生防潜力的高低。松材线虫生物防治研究在菌株筛选和部分代谢产物结构、致病机理等方面已取得一定进展，要使这些科研成果更好的應用于松材线虫病防治实践，应针对不同种类的生物资源开展更加深入、系统研究。 参 考 文 献 [1]杨宝君，潘宏阳，汤坚，等.松材线虫病（Bursaphelenchus xylophilus）[M].北京：中国林业出版社，2003：1-9. 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