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甘蓝型油菜脂肪酶基因BnGLIP1的克隆与分析

范文

李明丁丽娜王政曹维王玉康张洁夫谭小力

摘要：植物GDSL脂肪酶是一个重要的脂肪酶家族，具有水解酶活性，在植物体内参与众多的生理活动。从甘蓝型油菜中克隆到1个GDSL类型脂肪酶基因，将其命名为BnGLIP1。该脂肪酶基因编码的蛋白有360个氨基酸，含有20种氨基酸，分子质量为39 545.35 u，理论等电点为4.95。生物信息学分析表明，该蛋白属于稳定性蛋白，可能为亲水性蛋白;编码蛋白的N端具有信号肽序列，推测可能为外分泌蛋白;蛋白质二级和三级结构显示α螺旋和无规则卷曲所占比例较高。组织特异性表达分析表明，BnGLIP1在甘蓝型油菜的根、茎、茎尖、叶、花、角果、种子等中均有表达，其中角果中的表达量最高，茎中最低。干旱、高盐等胁迫处理均能诱导BnGLIP1的表达，表明BnGLIP1脂肪酶基因在植物的胁迫响应中发挥作用。

关键词：甘蓝型油菜;BnGLIP1;生物信息学;表达模式分析;胁迫响应

中图分类号： S634.301;Q785文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2020）04-0059-06

收稿日期：2019-03-05

基金項目：国家重点研发计划（编号：2016YFD0100305）。

作者简介：李?明（1993—），女，山东菏泽人，硕士研究生，研究方向为模式生物功能基因组学和蛋白质组学。E-mail：LMING0309@126.com。

通信作者：谭小力，博士，研究员，研究方向为油菜功能基因组学。E-mail：xltan@ujs.edu.cn。

油菜是继水稻、小麦、玉米和大豆之后的第五大农作物，主要分布在长江流域，属于十字花科，主要分为三大类型，即白菜型油菜、芥菜型油菜和甘蓝型油菜。其中甘蓝型油菜（Brassica napus L.）是我国重要的油料作物，油菜籽中除含有丰富的油脂外，还含有丰富的蛋白质，是一种潜在的植物蛋白资源[1]。此外，油菜又是生物柴油的理想原料，是一种优质能源，油菜生产对保障我国食用油安全供给有重要意义，同时对发展生物能源也有潜在价值[2]。

GDSL脂肪酶是具有多功能性质的水解酶，在多种植物体中均有发现[3-6]。近年来许多研究发现，GDSL在植物生长发育、器官形态发生、逆境胁迫和脂代谢等方面发挥着重要作用[7-10]。譬如，BnLIP2在油菜的种子萌发、形态建成及开花过程中起着重要作用[11]。Takahashi等鉴定到了1个拟南芥CDEF1（cuticle destructing factor 1）基因，该基因表达的蛋白属于GDSL脂肪酶/酯酶家族，参与花粉管穿透柱头并且可促进侧根的形成[12]。此外，Kim等研究发现，拟南芥glip1-1突变体在接种坏死病原菌后表现出诱导抗性缺陷，而在过表达GLIP1基因植株中则表现出对多种病原菌的抗性[13]。与野生型植株相比，AtGDSL1和BnGDSL1过表达株系的种子发芽率和成苗率均有提高，与此同时，AtGDSL1和BnGDSL1的组成性过表达促进了脂肪分解代谢，降低了种子油含量[14]。另外，Chen等研究表明，GDSL脂酶家族成员可以通过降解脂肪酸而影响种子脂肪酸的含量[15]。在油菜中过表达棉花基因GhGLIP后，显著提高了油菜种子中的油脂含量[16]。

与微生物、动物GDSL脂肪酶研究相比，植物中该类脂肪酶的研究较少，尤其是关于油料作物脂肪酶基因，有很多问题亟待发现和研究。本研究从甘蓝型油菜中分离得到了1个GDSL脂肪酶基因（BnGLIP1），进一步对其进行生物信息学分析及表达分析，预测其结构与功能，为深入研究其生化功能打下基础。

1?材料与方法

1.1?试验材料与试剂

1.1.1?植物材料

甘蓝型油菜中双11号种子购于武汉中油种业科技有限公司，培养室生长条件如下：温度为（20+2） ℃，湿度为60%～90%，每天光周期为光照8 h/黑暗16 h，光照度为150 μmol/（m2·s）。生长15 d后分别取幼苗的根、叶、茎和茎尖，另外在开花7 d后取新鲜的花，待开花30 d后取幼嫩的角果和种子，将所取材料置于-70 ℃ 冰箱备用。

1.1.2?试剂

TRIzolTM Reagent，购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司;DH5α化学感受态细胞、HiScript Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）反转录试剂盒、AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，均购自南京诺唯赞生物科技有限公司;琼脂糖凝胶回收试剂盒E.Z.N.A.Gel Extraction Kit，购自Omega Bio-Tek公司;KOD-Plus-Neo高保真酶，购自东洋纺（上海）生物科技有限公司;pMDTM18-T Vector克隆试剂盒，购自宝日医生物技术（北京）有限公司。

1.2?试验方法

1.2.1?油菜总RNA提取以及cDNA合成

采用Trizol试剂快速提取法提取油菜总RNA。首先取少量组织用液氮速冻，研磨至粉末状，之后加入1 mL预冷的Trizol，充分混合后冰上静置10 min，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min。待完成后，取约800 μL 上清加入300 μL三氯甲烷并剧烈振荡，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min。随后取上清加入等体积异丙醇轻摇，4 ℃、12 000 r/min离心10 min;弃上清加入75%乙醇充分洗涤，4 ℃、12 000 r/min离心5 min。最后弃上清，干燥沉淀，加入DEPC水溶解，-70 ℃保存备用。

cDNA合成是以总RNA为模板，采用反转录试剂盒说明书进行反转录合成第1链。

1.2.2?序列克隆

根据BnaC07g35650D序列设计引物进行克隆，扩增BnGLIP1的引物序列如下：OL-F：5′-GGATAAGGTTTTTTCCAGAGAG-3′和OL-R：5′-TCTTTGTCTGTGTGGAGGAA-3′。以甘蓝型油菜中双11号的cDNA为模板，使用高保真聚合酶KOD-Plus-Neo进行目的片段扩增，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收扩增产物，并将产物连接到pMD18-T载体从而构建成为BnGLIP1-pMD18-T载体，之后转化进大肠杆菌DH5α感受态细胞，并将阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.2.3?蛋白生物信息学分析

利用Primer 5软件预测目的基因BnGLIP1编码的氨基酸序列;蛋白的理化性质利用在线工具ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）进行分析;利用NCBI中的CDD数据库[17]对蛋白保守结构域进行预测;使用MEGA 5.1软件进行多种氨基酸序列比对;利用ProtScale分析蛋白的亲疏水性;运用SignalP 4.1 Server对蛋白序列的信号肽进行预测;运用TargetP 1.1 Server预测真核细胞蛋白的亚细胞定位[18];利用SOPMA和SWISS-MODEL分别对蛋白的二级结构和三级结构进行预测。

1.2.4?环境胁迫处理

选用生长至4叶1心期的油菜幼苗进行不同环境胁迫模拟处理。干旱胁迫处理：用聚乙二醇（PEG）溶液模拟干旱，将浓度为20%（W/V）的PEG溶液喷施于油菜叶片上，黑暗培养24 h。盐胁迫处理：将浓度为25 mmol/L的NaCl溶液喷施于油菜叶片上，黑暗培养24 h。低温、高温胁迫处理：分别将油菜置于4 ℃冰箱和37 ℃培养箱，黑暗培养24 h。以室温下正常生长的幼苗作为对照。上述每种处理均设置3个生物学重复。

1.2.5?表达分析

根据BnGLIP1基因序列的非保守区设计实时荧光定量PCR引物，引物序列如下：qPCR-F：5′-AGATTCCTTTGCCAACGACC-3′和qPCR-R：5′-ACCCTAAACCCATAGCGAGA-3′，選取甘蓝型油菜Actin基因（GenBank：AF111812.1）作为内参基因，内参引物序列如下：Actin-RTF：5′-TGTTGCTATCCAGGCTGTTCTTTC-3′和Actin-RTR：5′-GATAGCGTGAGGAAGAGCATAACC-3′。以反转录第1条链cDNA为模板，具体操作方法根据AceQ qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒说明书进行，试验数据采用GraphPad Prism 7软件进行分析。

2?结果与分析

2.1?甘蓝型油菜BnGLIP1基因的全长cDNA克隆

本研究从甘蓝型油菜中双11中分离得到了BnaC07g35650D的全长cDNA，核苷酸序列和预测的氨基酸序列如图1所示，该序列的开放阅读框长1 083 bp，编码360个氨基酸，将克隆到的基因命名为BnGLIP1（B.napus GDSL LIPASE-LIKE1）。

2.2?蛋白性质的生物信息学分析

2.2.1?蛋白理化性质分析

利用ProtParam进行蛋白的理化性质预测，分析结果显示BnGLIP1蛋白由360个氨基酸组成，分子式为C1 741H2 663N483O536S19，分子质量为39 545.35 u，理论等电点为4.95，此蛋白由20种氨基酸组成，其中所占比例最高的3个氨基酸为Ala（8.9%）、Asn（8.9%）和Gly（9.2%），带负电荷的残基总数（Asp+Glu）为34个，带正电荷的残基总数（Arg+Lys）为25个。

2.2.2?蛋白保守结构域分析

与其他脂酶（lipase）相似，GDSL类脂酶同样以丝氨酸作为水解催化位点，但不同的是丝氨酸位于蛋白N端。此外，GDSL脂酶还具有至少4个保守的结构区域（block）[6]。利用NCBI的CDD数据库预测BnGLIP1蛋白的保守结构域特征，结果显示此蛋白属于植物SGNH脂肪酶家族（图2）。使用MEGA 5.1软件对来自不同物种的氨基酸进行序列比对，发现甘蓝型油菜BnGLIP1蛋白具有很高的保守性，其中它与拟南芥中的同源蛋白（AAL24090.1）同源性最高，为90.83%，其次为另一种拟南芥同源蛋白（NP_199379.1），同源性为81.94%。如图3所示，BnGLIP1具备GDSL脂肪酶的序列特征，一级结构主要包括5个保守区域（Ⅰ～Ⅴ）。

2.2.3?蛋白的亲疏水性预测

甘蓝型油菜BnGLIP1蛋白由360个氨基酸组成，为进一步了解编码蛋白的亲疏水性，利用ProtScale对其进行详细分析发现，虽然某些氨基酸表现出较强的疏水性，但亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸，因此可以预测此蛋白为亲水性蛋白（图4）。

2.2.4?信号肽分析以及亚细胞定位预测

如图5所示，运用SignalP 4.1 Server对蛋白序列的信号肽进行预测，发现前21个氨基酸的信号肽（S）值处于最高，在0.637～0.943之间浮动，并且在第22个氨基酸处骤降至0.137，之后处于一个平稳水平;在第22个氨基酸处出现剪切位点（C）最高值0.877;Y值也在第22个氨基酸处出现最高值。由此可知，此BnGLIP1 蛋白有信号肽序列?推测其可能为外分泌蛋白。另外，利用TargetP 1.1 Server对其进行亚细胞定位预测，定位依据的是任何一个N-末端存在序列，如叶绿体转运肽、线粒体靶向肽或分泌途径信号肽等。分析结果显示，分泌途径中的信号肽（SP）数值为0.976，并且可靠指数RC为1，表明其为一个分泌蛋白（表1），定位在细胞外。根据以上预测结果分析，推测BnGLIP1很可能是一个分泌蛋白。

2.2.5?二级、三级结构预测

氨基酸序列决定了蛋白质的二级、三级结构，蛋白质结构决定了其功能。为了探讨BnGLIP1蛋白质结构，利用SOPMA在线分析软件对其二级结构进行预测。如图6所示，α螺旋（蓝色）占38.06%，延伸链条（红色）占16.11%，β转角（绿色）占3.61%，紫色代表无规则卷曲，占42.22%（图6）。该结果与SWISS-MODEL软件进行的三级结构的预测结果相吻合（图7）。

2.3?BnGLIP1基因表达模式分析

2.3.1?组织特异性表达分析

采用qRT-PCR技术检测BnGLIP1在甘蓝型油菜不同组织包括根、茎、叶、花、茎尖、角果、种子中的表达模式，结果发现此基因在各个组织中均有表达，但在各个组织中的表达量存在显著差异。其中以根作为对照，基因在角果中的表达量最高，约是根中表达量的8.95倍，在叶和茎中表达量相对较低（图8）。

2.3.2?各种环境因子对BnGLIP1表达的影响

qRT-PCR分析显示，在PEG溶液处理24 h时，与对照（CK）相比，BnGLIP1的相对表达量显著提高。25 mmol/L NaCl处理也可以诱导BnGLIP1的表达。另外，在4 ℃低温、37 ℃高温处理条件下，BnGLIP1的相对表达量下降（图9）。这些结果表明，BnGLIP1可能参与植物对环境胁迫的应答反应。

3?讨论与结论

甘蓝型油菜是我国及世界上最重要的油料作物之一。植物脂肪酶具有广泛的生理功能，能催化水解反应，还可能催化酯化、醇解、酸解等多种反应，在油脂分解反应及油脂改造中具有潜在应用价值。

本研究以我国长江中下游油菜主产区具有优良抗逆特点的甘蓝型油菜品种中双11号为材料，克隆了1个重要的GDSL脂肪酶基因BnGLIP1，并通过生物信息学方法分析了其基本理化性质以及结构特点等。利用NCBI的CDD数据库分析发现，BnGLIP1蛋白属于植物SGNH脂肪酶家族。对来自不同植物物種的GDSL同源蛋白进行序列比对分析发现，BnGLIP1在不同的物种中具有很高的保守性，特别是与双子叶植物油菜、拟南芥、山茱萸的GDSL脂肪酶在氨基酸水平上有很高的同源性。

植物基因在各组织器官的表达情况对其功能具有很大的影响，如Kondou等研究了拟南芥的RGE1基因，该基因在种子萌发阶段的胚乳中特异表达，在心形阶段控制胚胎的发育中起着重要的作用[19]。笔者利用qRT-PCR比较了该基因在不同组织中的表达，结果发现该基因在不同组织中的表达差异较大，其中在角果中表达量最高，推测此基因可能在角果期发挥功能。与笔者研究结果一致，目前所报道的脂肪酶基因在不同组织器官中的表达特征呈现出多样性，Lee等发现拟南芥GLIP2在根和茎以及早期幼苗阶段（1周龄）中高表达，而GLIP1在1周龄幼苗、花、叶、茎、根等阶段均有表达[20]。此外，它的表达还受到干旱、高盐等各种环境胁迫的诱导，受到低温、高温等环境条件的抑制，表明BnGLIP1基因除了参与脂肪酸代谢外，也参与了对环境胁迫的响应。

生物信息学分析还发现，BnGLIP1蛋白含有1段跨膜结构域，都属于亲水性蛋白，在N端有1段含有25个氨基酸序列的信号肽，可能分泌到细胞外。TargetP 1.1 Server分析发现，SP数值为0.976，更进一步说明了它是一个分泌蛋白。在拟南芥中，其同源蛋白GDSL脂肪酶GLIP1也是一个分泌蛋白，它通过信号传导调节激活植物局部和系统的抗性，在植物免疫反应中发挥了重要作用[21]。所以笔者推测甘蓝型油菜BnGLIP1很可能也是一个植物防卫反应相关的蛋白，通过对其进行转基因及酶活分析将有助于进一步了解BnGLIP1的生物学功能。

参考文献：

[1]解?蕊. 一种潜在的植物蛋白资源——菜籽蛋白的开发[J]. 农产品加工，2003（1）：26-27.

[2]王汉中. 发展油菜生物柴油的潜力、问题与对策[J]. 中国油料作物学报，2005，27（2）：74-76.

[3]Lai C P，Huang L M，Chen L O，et al. Genome-wide analysis of GDSL-type esterases/lipases in Arabidopsis[J]. Plant Molecular Biology，2017，95（1/2）：181-197.

[4]Chepyshko H，Lai C P，Huang L M，et al. Multifunctionality and diversity of GDSL esterase/lipase gene family in rice （Oryza sativa L. japonica） genome：new insights from bioinformatics analysis[J]. BMC Genomics，2012，13（1）：309.

[5]Volokita M，Rosilio-Brami T，Rivkin N，et al. Combining comparative sequence and genomic data to ascertain phylogenetic relationships and explore the evolution of the largeGDSL-lipase family in land plants[J]. Molecular Biology and Evolution，2011，28（1）：551-565.

[6]Akoh C C，Lee G C，Liaw Y C，et al. GDSL family of serine esterases/lipases[J]. Progress in Lipid Research，2004，43（6）：534-552.

[7]Ji R，Wang H，Xin X，et al. BrEXL6，a GDSL lipase gene of Brassica rapa，functions in pollen development[J]. Biologia Plantarum，2017，61（4）：685-692.

[8]Ma R，Yuan H，An J，et al. A Gossypium hirsutum GDSL lipase/hydrolase gene （GhGLIP） appears to be involved in promoting seed growth in Arabidopsis[J]. PLoS One，2018，13（4）：e0195556.

[9]Kwon S J，Jin H C，Lee S，et al. GDSL lipase-like 1 regulates systemic resistance associated with ethylene signaling in Arabidopsis[J]. The Plant Journal，2009，58（2）：235-245.

[10]Zhang Y J，Bai B，Lee M，et al. Cloning and characterization of EgGDSL，a gene associated with oil content in oil palm[J]. Scientific Reports，2018，8（1）：11406.

[11]Ling H，Zuo K，Zhao J，et al. Isolation and characterization of a homologous to lipase gene from Brassica napus[J]. Russian Journal of Plant Physiology，2006，53（3）：366-372.

[12]Takahashi K，Shimada T，Kondo M，et al. Ectopic expression of an esterase，which is a candidate for the unidentified plant cutinase，causes cuticular defects in Arabidopsis thaliana[J]. Plant & Cell Physiology，2010，51（1）：123-131.

[13]Kim H G，Kwon S J，Jang Y J，et al. GDSL lipase 1 regulates ethylene signaling and ethylene-associated systemic immunity in Arabidopsis[J]. FEBS Letters，2014，588（9）：1652-1658.

[14]Ding L N，Guo X J，Li M，et al. Improving seed germination and oil contents by regulating the GDSL transcriptional level in Brassica napus[J]. Plant Cell Reports，2019，38（2）：243-253.

[15]Chen M X，Du X，Zhu Y，et al. Seed Fatty Acid Reducer acts downstream of gibberellin signalling pathway to lower seed fatty acid storage in Arabidopsis[J]. Plant，Cell & Environment，2012，35（12）：2155-2169.

[16]郝曉云，蔡永智，袁哈利，等. 过量表达棉花GDSL脂肪酶提高甘蓝型油菜油脂含量的研究[J]. 中国粮油学报，2014，29（6）：63-68，73.

[17]Marchler-Bauer A，Derbyshire M K，Gonzales N R，et al. CDD：NCBIs conserved domain database[J]. Nucleic Acids Research，2015，43：D222-D226.

[18]Emanuelsson O，Brunak S，von Heijne G，et al. Locating proteins in the cell using TargetP，SignalP and related tools[J]. Nature Protocols，2007，2（4）：953-971.

[19]Kondou Y，Nakazawa M，Kawashima M，et al. RETARDED GROWTH OF EMBRYO1，a new basic helix-loop-helix protein，expresses in endosperm to control embryo growth[J]. Plant Physiology，2008，147（4）：1924-1935.

[20]Lee D S，Kim B K，Kwon S J，et al. Arabidopsis GDSL lipase 2 plays a role in pathogen defense via negative regulation of auxin signaling[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2009，379（4）：1038-1042.

[21]Oh I S，Park A R，Bae M S，et al. Secretome analysis reveals an Arabidopsis lipase involved in defense against Alternaria brassicicola[J]. The Plant Cell，2005，17（10）：2832-2847.

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