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猪乙型脑炎病毒SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

范文

常晨张道华唐波刘国阳华涛王海燕

摘要：为建立猪乙型脑炎病毒（JEV）的定量检测方法，根据E基因序列，设计1对特异性引物，建立检测JEV的荧光定量PCR方法。结果显示，该方法灵敏度达到103拷贝/μL，对猪圆环病毒2型（PCV2）、猪细小病毒（PPV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病毒（PRV）均无交叉反应，具有良好的特异性和重复性;采用JEV攻毒小鼠，荧光定量PCR比普通PCR更能灵敏地检出组织带毒量。该方法可用于组织样品中乙脑病毒的定量检测以及临床乙脑病毒感染的早期检测和定量分析猪乙脑病毒感染程度。

关键词：猪乙脑病病毒;SYBR-GreenⅠ;荧光定量PCR;检测

中图分类号： S852.65文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2020）18-0081-05

收稿日期：2019-12-04

基金项目：国家重点研发计划（编号：2018YFD0500800）;公益性行业（农业）科研专项（编号：201403051）;江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（17）3049]。

作者简介：常?晨（1987—），女，江苏南京人，硕士，助理研究员，主要从事动物疫苗产品研究工作。E-mail：346283525@qq.com。

通信作者：张道华，硕士，研究员，主要从事动物分子病原学及免疫学研究。E-mail：zhangdh2005@163.com。

日本流行性乙型脑炎（乙脑，Japanese encephalitis，JE）是由乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起的一种人畜共患传染病。乙型脑炎病毒主要通过携带病毒的蚊虫叮咬传播，库蚊、伊蚊和按蚊是JEV的主要传播媒介，猪是主要贮存宿主及扩散宿主，JE主要发生于夏秋季节。猪乙脑病常引起妊娠母猪流产、产死胎或弱胎，公猪睾丸炎，育肥猪持续高热，新生仔猪神经症状，对养殖业安全生产带来严重威胁[1-2]。对猪进行疫苗免疫能有效减少JEV对养猪业造成的危害，进行及时正确的诊断是预防和控制该病的关键[3]。

诊断猪乙型脑炎的病原学方法有病毒分离鉴定、RT-PCR检测、荧光定量RT-PCR、荧光环介导逆转录等温扩增（RT-LAMP）、基因芯片技术等[4]。孙静等曾报道，采用RT-PCR方法检测JEV，虽灵敏且能在疾病早期对病毒进行检测，但由于分析步骤繁琐且容易造成污染，所以使用受到限制[5]。荧光定量RT-PCR方法操作简便、灵敏度高、特异性好，荧光染料SYBR-GreenⅠ荧光信号的积累与扩增的双链DNA数量呈正相关，该方法成本较探针法低，且可达到快速、定量的目的，对疾病的早发现、早预防起着重要的作用[6]。

JEV为单股正链RNA病毒，E基因是乙脑病毒毒力基因，E蛋白为该病毒的主要表面结构蛋白，存在大量的中和抗原表位，是病毒重要的抗原决定簇[7]。本研究以E基因序列作为靶序列设计1对引物，利用SYBR-GreenⅠ荧光染料定量PCR方法，定量检测组织中的病毒含量，对诊断乙脑早期感染和对病毒净化有重要意义。

1?材料与方法

1.1?毒株与试验动物

JEV J3株、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪细小病毒（PPV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病毒（PRV），由笔者所在实验室分离与保存;1周龄无特定病原体（SPF）级BALB/c小鼠，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供。

1.2?主要试剂与仪器

RNA iso Reagent试剂盒、DL 2000 Marker、Ex TaqTM、SYBR Premix Ex TaqTM 、pMD18-T载体、凝胶回收试剂盒、载体连接试剂盒、质粒小量提取试剂盒、DH5α感受态细胞，购自宝生物工程（大连）有限公司;Rotor-Gene 3000荧光定量PCR仪，购自美国Gene公司。

1.3?引物设计与合成

根据Gen Bank中JEV的E基因序列设计获得重组质粒标准品引物，即上游引物：5′-TTGGTCGCTCCGGCTTACAG-3′;下游引物：5′-GCCACTTCCACACCTCATCT-3′，目的片段大小为1 574 bp。设计获得荧光定量PCR上下游引物，即上游引物：5′-AGAGCGGGGAAAAAGGTC-3′;下游引物：5′-TTTCACGCTCTTTCTACAGT-3′，目的片段大小为 162 bp。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.4?质粒模板标准品的制备

提取JEV J3株病毒RNA并反转录获得cDNA，通过PCR扩增获得乙脑E基因片段，PCR运行程序如下：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 15 min，30个循环;72 ℃ 10 min。对扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段采用凝胶回收试剂盒回收，将回收产物连接至 pMD-18T载体上，并转化至DH5α感受态细胞中。提取获得重组质粒后，进行酶切鉴定。将酶切大小正确的重组质粒送至上海英骏生物技术有限公司进行测序。将经测序验证的阳性质粒作为质粒标准品，命名为pMD-JEV-E。

1.5?SYBR-GreenⅠ荧光定量PCR反应体系及标准曲线的建立

采用紫外分光光度计测量质粒标准品pMD-JEV-E的吸光度，并计算拷贝数，以10倍梯度稀釋质粒为模板进行荧光定量PCR扩增，得到动力学曲线及标准曲线。PCR扩增体系为20 μL反应体系，其中上、下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），SYBR Premix Ex TaqTM 10.0 μL，模板2.0 μL，灭菌去离子水7.2 μL。反应的循环参数为95 ℃ 5 min;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。

1.6?重复性检验

选取乙脑病毒同一浓度的质粒进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR反应，每个样品做3个重复，通过CT值和溶解曲线峰值温度分析验证JEV SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的重复性与稳定性。

1.7?特异性检验

提取JEV、CSFV病毒液总RNA，再反转录为cDNA。提取PRV、PPV、PCV2病毒液DNA，按照SYBR GreenⅠ荧光定量PCR反应体系检测上述病毒核酸，同时设置阴性对照组，验证本研究方法特异性。

1.8?敏感性检验

对质粒标准品进行10倍梯度稀释，将稀释为 1～108拷贝/μL 的质粒作为模板进行荧光定量PCR扩增，分析本研究方法检出的最低拷贝数。

1.9?对免疫攻毒小鼠脑组织的检测

选取SPF级BALB/c小鼠10只，乙脑灭活苗免疫小鼠5只，同时设空白小鼠5只，6 d后加免，9 d后进行腹腔攻毒，JEV J3株F3代100 LD50 （100倍半数致死量）0.2 mL/只，同时对小鼠进行脑部空刺，攻毒后每日观察，取濒死小鼠的脑部组织，研磨、提取组织RNA并进行反转录，通过本研究方法和普通PCR进行检测。

2?结果与分析

2.1?JEV E基因PCR扩增与测序

由图1可知，PCR产物电泳结果显示，扩增产物在1 000～2 000 bp之间，测序得片段大小为 1 574 bp，与预计的片段大小相符。

2.2?标准曲线的建立

将重组质粒进行10倍梯度稀释，选取合适浓度范围（104～109拷贝/μL）的质粒进行荧光PCR，并通过LightCycler 480进行数据分析，样品在该范围内具有良好的扩增曲线（图2）。由图3可知，倍比稀释质粒样品在此浓度范围内具有良好的扩增曲线，标准曲线的截距为41.24，斜率为-3.761，扩增效率为99.5%，误差为0.019 5，判定系数R2为0.99。

2.3?重复性检测

为验证荧光定量PCR检测结果的可重复性，对每个稀释度（104～109拷贝/μL）重组质粒样品设3个重复进行检测试验，由图4可知，3次重复的动力学曲线重合，可见荧光定量PCR有很高的可重复性。

2.4?特异性检测

对猪病毒JEV、PRV、CSFV、PPV、PCV2的核酸及双蒸水进行荧光定量PCR检测，由图5可知，JEV在5个循环左右开始起峰，而其他病毒及双蒸水均在35个循环后起峰，均为非特异性起峰，表明该方法具有良好的特异性。

2.5?敏感性检测

将10倍梯度稀释后的质粒（100～108拷贝/μL）作为模板，采用建立的荧光定量PCR方法进行检测。由图6可知，当模板浓度为 103拷贝/μL 时，检测结果仍为有规律的S型荧光曲线。说明本研究方法的最低检测限为103拷贝/μL。

2.6?对免疫攻毒小鼠脑组织的检测

由表1、表2可知，采用本研究方法检测到对照组攻毒小鼠的脑组织中乙脑病毒结果均为阳性，且可计算出组织中的病毒载量，免疫组攻毒小鼠仅1只检测结果呈阳性，而PCR检测仅部分结果呈阳性，且无法计算出组织中的病毒载量。

3?讨论

乙型脑炎是人兽共患病，且自然界中大部分脊椎动物均是乙型脑炎病毒易感宿主，提高乙脑病毒检测的质量和效率对乙脑病毒的发现和预防有重要作用。乙脑病毒感染至产生抗体存在一定的“窗

口期”，故抗体检测不利于乙脑的早期诊断[8]。病毒分离与鉴定操作繁琐、耗时多、灵敏度不高，不能实现乙脑病毒的快速检测，RT-PCR可获得很好的检测效果，但不能对病原定量分析。刘卫滨等根据JEV NS5基因[9]、霍红等根据E基因分别设计引物与探针[10]，建立了TaqMan荧光定量RT-PCR方法，通过该方法检测猪血清样品的灵敏度可达10拷贝/μL，但其成本高，需结合特异性探针。韩国学者Jeong等利用荧光染料SYBR Green Ⅰ构建实时荧光PCR检测JEV方法，将扩增区段选定在3′端非编码区（共323 bp），该区段的GC含量高并存在连续的G或C，且3′端非编码区在病毒基因组中能够形成一定的空间结构，不利于逆转录过程引物的退火与cDNA合成过程，所以本研究未将3′端非编码区作为扩增检测分析目的区段[10]。本研究根据JEV E基因片段保守序列，设计合成荧光定量PCR上下游引物，结果显示，本研究方法不仅呈现良好的特异性，检测灵敏度也达到103拷贝/μL，与常规的PCR方法相比，该方法更精确、更省时、操作更简便。本试验建立了SYBR-Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法，选取猪乙型脑炎病毒E基因的重组质粒作为标准品，建立标准曲线，检测结果为良好的S型荧光曲线，且具有很好的重复性，能够灵敏地检测出病毒感染的情况。

为了更好地验证本研究建立的荧光定量PCR方法的可操作性、灵敏性、实用性，利用该方法检测攻毒保护试验中小鼠脑组织的病毒载量，发现各稀释质粒样品均具有良好的扩增曲线，根据CT值和标准曲线公式可精确计算出组织中的初始病毒量，与该方法相比，普通PCR方法有很多阳性漏检。荧光定量PCR检测不需要通过凝胶电泳检测和测序分析，节约了试验时间和成本。

本试验建立的SYBR-Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法，有助于分析在乙脑的发病过程中JEV的动态变化与疾病发展的关系以及乙腦病毒感染的早期检测和定量分析猪乙脑病毒感染程度。

参考文献：

[1]Tiroumourougane S V，Raghava P，Srinivasan S. Japanese viral encephalitis[J]. Postgraduate Medical Journal，2002，78（918）：205-215.

[2]Yang D K，Jin-Ju N，Ha-Hyun K，et al. Inactivated genotype 1 Japanese encephalitis vaccine for swine[J]. Clinical and Experimental Vaccine Research，2014，3（2）：212.

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[4]吕玉金，吴凤笋，刘胜利，等. 猪日本乙型脑炎及猪细小病毒复合PCR检测方法的建立[J]. 江苏农业科学，2019，47（19）：176-179.

[5]孙?静，陶三菊，陈伯权. 逆转录-聚合酶链反应方法检测乙型脑炎病人标本[J]. 中华实验和临床病毒学杂志，2000，14（2）：184.

[6]庄金秋，梅建国，张?颖，等. 猪乙型脑炎病毒试验室检测方法研究进展[J]. 中国动物检疫，2017，34（11）：60-63.

[7]Sumiyoshi H，Mori C，Fuke I，et al. Complete nucleotide sequence of the Japanese encephalitis virus genome RNA[J]. Virology，1987，161（2）：497-510.

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[9]刘卫滨，付士红，宋?宏，等. 乙型脑炎病毒TaqMan PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 中华微生物学和免疫学杂志，2005，25（8）：656-662.

[10]霍?红，李业南，薛?遥，等. 猪流行性乙型脑炎病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立[J]. 中国预防兽医学报，2014，36（7）：547-550.

[11]Jeong H S，Shin J H，Park Y N，et al. Development of real-time RT-PCR for evaluation of JEV clearance during purification of HPV type 16 L1 virus-like particles[J]. Biologicals，2003，31（3）：223-229.

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