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松突圆蚧及相近种类DNA条形码特征及系统发育初探

范文

禹海鑫　马福欢　孙民琴　李琨渊　郭骁驹

摘要：介壳虫尤其是检疫性害虫——松突圆蚧及相近种类严重危害我国的农林业生产，为丰富蚧虫的基因条形码数据库，探索松突圆蚧及相近种类的系统发育关系，以利于用28S rRNA基因作DNA条形码快速准确地鉴定这些蚧虫种类。应用PCR技术扩增10种松突圆蚧及相近种类的28S rRNA序列并进行序列比对，以分析其序列组成变异及碱基替换规律，最后利用MEGA 5.0构建系统进化树。结果表明，28S rRNA作为DNA条形码能够很好地区分鉴定10种蚧虫。

关键词：松突圆蚧;28S rRNA;DNA条形码;系统发育

中图分类号： S433.3? 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2020）19-0111-04

收稿日期：2019-11-29

基金项目：南京海关科技计划（编号：2018KJ58）。

作者简介：禹海鑫（1984—），男，河南泌阳人，博士，高级农艺师，主要从事植物检疫、昆虫分类和昆虫分子化学生态学研究。Tel：（0513）68588180，E-mail：haixin.007@163.com。

盾蚧科（Diaspididae）属于昆虫纲（Insecta）半翅目（Hemiptera）蚧总科（Coccoidea），是蚧总科中种类较丰富的类群之一，该科蚧虫往往分布广、危害大、防控难，且个体微小，易于藏匿，主要以成虫和若虫取食寄主植物的幼嫩部位，刺吸植物地上部分的叶片、茎及树皮等部位汁液进行危害，少部分刺吸植物地下部分的根及块根，使植物的生长势头变弱。它们还可以通过携带病原微生物进行传播，导致植物病害大面积发生;另外，虫体排出的蜜露常诱致煤污病的产生，从而影响生物光合作用，对松林资源、自然景观等生态影响巨大，不少盾蚧科种类是重要的农业及林业害虫[1]。其中，松突圆蚧（Hemiberlesia pitysophila）由于对我国松林能够产生严重危害，被2007 年发布的《进境植物检疫性有害生物名录》列为我国检疫性昆虫[2]。

近年来，随着我国外向型经济的发展，种苗花卉等货物的进出口量剧增，国内多个口岸在进境种苗花卉、船舶、集装箱检疫工作中也多次截获到检疫性松突圆蚧及其近似种类[3]，但该类蚧虫常常会以卵、若虫、雄虫、身体破损等的形式出现，快速准确鉴定相当困难。因此，需要探索新方法来解决传统形态学鉴定中遇到的困境。随着分子试验技术的迅猛发展，利用DNA条形码研究种类鉴定、系统发育已经成为昆虫学研究的热点。常用的DNA条形码包括线粒体DNA（mitochondrial DNA，简称mtDNA）[4]、ITS2[5]、28S[6] 和18S[7]，均已被广泛应用于蚧虫的分子鉴定研究中。王玉生利用双基因条形码鉴定技术研究我国常见粉蚧类害虫的种类分布[8]。石晶晶基于分子标记COⅠ、28S、18S实现了对新菠萝灰粉蚧与菠萝粉蚧种类的多基因条形码分子鉴定识别[9]。此外，Geoffrey等对盾蚧科2个亚科 5个族47个属89个种的91个标本基于核基因 EF-lα 和 28S rRNA 进行了系统发育分析，该研究是第1次针对盾蚧科类群采用分子生物学方法进行的系统发育分析，但该研究只收集了盾蚧科中2个主要亚科的标本，不能全面地表现该科中各类群之间的相互关系，其中采集于我国的标本只有1头[10]。何衍彪等通过对柑橘臀纹粉蚧、大洋臀纹粉蚧、无花果臀纹粉蚧3种近缘种粉蚧的COⅠ序列以及 18S rRNA 和 28S rRNA 基因序列的比对分析后，认为 COⅠ序列的變异程度更高，可以作为这3种近缘种粉蚧鉴别的依据[11]。

本研究对已获得的10种松突圆蚧及其近似种类的28S rRNA（28S）基因片段进行测序和对比，分析这些序列的特征及遗传系统发育关系，以获得能够准确鉴定这些蚧虫种类的分子方法，为研究其他蚧虫种类的分子鉴定方法提供有益参考。

1 材料与方法

1.1 昆虫标本

本试验所用的蚧虫标本由广东林业科学研究院、凭祥海关、石家庄海关、南通海关等单位提供，所有标本均经南京海关动植食中心实验室鉴定（表1）。

1.2 提取基因组DNA

采用北京金麦格生物技术有限公司购买的GenMagBio动物细胞组织/细胞基因组DNA磁珠提取试剂盒提取各样品的基因组DNA。提取方法：用双蒸水冲洗100%乙醇浸泡的蚧虫样品（应少于30 mg），转入1.5 mL离心管中，置于MM400球磨仪研磨30 s（30次/s）后，12 000 r/min离心 10 min。离心后加180 mL裂解缓冲液及20 mL Proteinase K，放于55 ℃水中温浴10 min。再加 200 mL 无水乙醇、200 mL缓冲液、20 mL磁珠，用磁珠来吸附基因组DNA，然后加500 mL Wash Buffer去杂。最后加20 μL Elution Buffer，静置5 min后洗脱磁珠就获得了样品的基因组DNA溶液[12]。

1.3 28S片段扩增和测序

在ProFlexTM PCR仪（购自ABI公司）上进行PCR反应。反应采用25 μL体系，其中2 μL MgCl2 （25 mmol/L），2.5 μL 10×buffer，1 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.4 μL rTaq DNA聚合酶（5 U/μL，购自TaKaRa公司），上、下游引物（10 μmol/L，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成）各0.5 μL，加灭菌水至25 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 变性40 s，58 ℃退火30 s，72 ℃保持1 min，设置35个循环;最后在72 ℃下延伸10 min。反应完毕将PCR产物送到南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。本试验PCR反应采用的引物为D2-3566F和D2-4068（表2）。

1.4 序列分析和建树

将测得的28S序列导入SeqMan分析软件中进行拼接及校正。利用NCBI中的Blast工具搜索相似性序列，以确认序列的方向和可信度。再将所测序列全部载入Clustal X 1.83软件中进行比对[13]。将序列比对结果导入MEGA 5.05软件中[18]算出蚧虫种类间的转换/颠换（R）、变异位点（V）、保守位点（C）等[12，14]。最后使用MEGA 5.05软件采用邻接法构建系统发育树，重复1 500次。

2 结果与分析

2.1 DNA凝胶电泳结果

本试验对10种蚧虫样品基因组DNA进行PCR扩增。由图1可知，10个样品在720 bp附近均有清晰明亮、特异性好的条带，且没有非特异性条带出现，可满足后续基因测序的需要。

2.2 蚧虫28S序列解析

2.2.1 28S序列特征

将各序列导入MEGA 5.05软件，均切成同等长度片段（684 bp）。结果表明，共有变异位点、保守位点、自裔位点和简约信息位点分别为226、454、150、75个。另外，统计所有位点碱基的平均含量（表3）发现，A的平均含量为16.7%，T（U）的平均含量为21.7%，G的平均含量为340%，C的平均含量为27.7% 。其中，G含量最高，A含量最低，C和G含量较接近，且C+G含量为61.7%，要高于A+T含量（38.4%），表现为明显的C+G碱基偏嗜，与高A+T含量的昆虫线粒体基因碱基组成基本特征有所不同[14]。

2.2.2 堿基替换规律分析

使用MEGA 5.05软件，计算全体位点及各位点的转换与颠换值以及其比值，结果表明，全体位点的转换主要发生在C与T间，颠换主要发生在G与C之间，转换/颠换比值（R值）为1.35。通过对密码子各位点的分析发现，转换主要发生在密码子的第1位点上，颠换主要发生在密码子的第3位点上。第1、2、3位点的R值分别为1.72、1.45、1.02。无论整体还是密码子的各位平均21.727.716.734.0638.9

点，其R值均小于2，说明该段序列转换与颠换未达到饱和，在探索系统发育树时应考虑转换和颠换的发生比率;且说明该段基因可靠度高，使用该基因得到的进化树也较为可靠（表4）。

2.2.3 基于28S序列的遗传距离

基于Kimure 2-parameter 模型分析10种蚧虫个体的遗传距离，将转换与颠换考虑在内，采用Bootstrap值（1 500次）进行检验[15]。由表5可知，相近种类的遗传距离数值在0.017～0.067之间，其中H.cyanophylli和 H.rapax的距离最小，为0.017;不隶属于同一个科的种类遗传距离较远，数值一般在0.248～0.347之间，其中C. hesperidum和H. pitysophila的距离最大，为0.347（表5）。结果表明，同隶属于盾蚧科的松突圆蚧及其相近种类的遗传距离较小，而隶属于不同科的种类之间的遗传差距较大，呈现出较为明显的遗传差异性，可将此段序列作为分析及鉴别物种的依据，此结论与基于COⅠ序列计算的遗传距离结果相一致。

2.2.4 建立系统发育树

利用 MEGA 5.05软件建立系统发育树，由图2可知，H. cyanophylli与H. rapax聚为一小枝，且与H. lataniae聚为一枝;H. pitysophila与H. palmae聚为一小枝，上述2枝又聚为一大枝。而同属于圆盾蚧亚科（Aspidiotinae）下的圆盾蚧属种类A. nerii、褐圆盾蚧属种类C. dictyospermi、蹄圆盾蚧属种类A. aurantii由近及远与圆盾蚧亚科种类形成的大枝聚在一起。? 此外，粉蚧科（Pseudococcidae）种类P. lilacinus、蜡蚧科（Coccidae）种类C. hesperidum明显位于外枝。上述结果表明，同隶属于圆盾蚧亚科栉圆盾蚧属（Hemiberlesia）下的各个种类亲缘关系最近，同隶属于圆盾蚧亚科不同属的种类亲缘关系次之，而隶属于不同科的种类间的亲缘关系最远，这与传统形态学分类方法的结果一致。同时，此结果也说明28S基因在蚧虫种间有很好的Bootstrop支持率，能将同属的蚧虫聚在一起，将不同科属的蚧虫区分清楚，从而成功地鉴定出上述10种蚧虫，因此很适合作为DNA条形码应用于松突圆蚧及相似种类的分子鉴定工作。

3 结论与讨论

28S rRNA基因含有较多既相对保守又有足够变异的遗传信息位点，常被当作DNA条形码用于物种鉴定及系统发育学研究中[8-9]。Geoffrey等对盾蚧科 2 个亚科 5 个族，47 个属 89 个种的 91 个标本基于核基因 EF-lα 和 28S rRNA 进行了系统发育分析[10]。该研究是第1次针对盾蚧科类群采用分子生物学的方法进行的系统发育分析。Deng等以蜡蚧科的 6种蜡蚧为靶标，对比 DNA 条形码序列与 28S 基因序列在鉴定上述介壳虫种类上的有效性，结果表明，利用 DNA 条形码序列鉴定的结果与形态鉴定的结果一致，更适合应用于同属介壳虫鉴定[16]。

近年来，随着我国外向型经济水平的持续提升，各口岸进出口种苗花卉量剧增。我国口岸从进口种苗花卉中截获的蚧虫种类、数量也出现了增长，但这些蚧虫多以卵、若虫、雄虫、样本受损等状态出现，用传统的形态鉴定方法存在着较大的困难。用28S rRNA基因片段作DNA条形码用于昆虫种类的分子鉴定，极大程度上克服了传统形态学鉴定的缺陷。

本研究通过对松突圆蚧及相近种类共10种蚧虫的28S基因序列进行比对分析，发现该序列既可有效区分蚧虫种类，又能提供丰富的物种亲缘关系信息。建立的系统发育进化树中包含的信息与传统的形态学鉴定结果相符。本试验结果不仅能对蚧虫28S rRNA基因序列的数据库进行补充和完善，也能为下一步将28S rRNA基因分析方法应用于口岸多种蚧虫种类鉴定及系统发育学研究提供基础。值得关注的是，由于不同的基因含有不同的遗传进化信息，也具有不相同的遗传进化速率，因此，在后续的蚧虫系统发育学研究中，为得到更精确的系统发育进化树，还需要在结合多个基因分析，多种成虫、幼虫形态特征及多种建树方法等方面继续努力。

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