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基于SSR标记的野生荷花遗传多样性分析及指纹编码构建

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徐君　尹江海　李欣　李军　靖晶　王欢　姜红卫

摘要：为进一步了解野生荷花资源的遗传特征，明确荷花育种亲本的遗传背景，以苏州市农业科学院荷花种质资源圃收集的15个野生荷花资源为材料，选择17对引物，包括15对SSR引物和2对cpSSR引物进行扩增，将扩增获得的结果用于构建野生荷花DNA指纹图谱，并开展遗传多样性分析。结果显示，15对SSR引物在15个野生荷花中共扩增位点72个，平均每对引物4.8个，其中多态性位点有72个，PPL为100%，PIC介于0.371～0.834之间;2对cpSSR引物共检测到9个单倍型位点，平均每对引物4.5个，其中多态性位点有8个，PPL为88.9%。野生荷花材料间遗传相似系数介于0.530 9～0.925 9之间，平均值为0.676 2，采用UPGMA聚类，以系数0.669 6为依据，可将供试的15个野生荷花分为3组。

关键词：野生荷花;SSR;指纹编码;UPGMA聚类;遗传多样性分析

中图分类号： S682.320.1? 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2020）19-0035-05

收稿日期：2019-12-30

基金项目：江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（19）3119];苏州市应用基础研究项目（编号：SNG2018058）。

作者简介：徐君（1982—），男，江苏苏州人，硕士，副研究员，主要从事水生植物分子生物学研究。E-mail：sacxujun@163.com。

通信作者：尹江海，硕士，副教授，主要从事农业经济管理研究。E-mail：yjh721218@126.com。

荷花（Nelumbo nucifera Gaertn.）是睡莲科（Nymphaeaceae）莲属（Nelumbo Adans.）多年生水生草本花卉，现存莲属植物有2个种，分别为亚洲莲和美洲黄莲。我国是亚洲莲的原产地之一，北至黑龙江省富锦市，南至海南岛，东至上海、台湾等地区，西至新疆天山地区，都有荷花的分布[1]。由于荷花具有较高的观赏、经济、文化和生态价值[2]，一直深受育种专家和消费者的喜爱。从20世纪80年代开始，我国的育种专家通过引进美洲黄莲，并与亚洲莲杂交，结合辐照等育种手段，创制了大量的荷花新品种[3]。而分布于各地原生境的野生荷花蕴藏着丰富的优质性状，是极好的荷花育种亲本材料。因此搜集野生荷花资源，并对资源进行鉴定和分类，对于进一步利用好野生荷花资源服务于荷花育种工作有着重要的现实意义。

野生荷花一般为原始的单瓣品种，仅仅通过形态学很难完全区分，且形态学鉴定具花费周期较长、结果易受人为因素干扰等缺点[4]。相对于形态学鉴定，分子标记鉴定是一种快速、简便、经济的方法。目前，扩增片段长度多态性（AFLP）[5]、随机扩增多态性DNA标记（RAPD）[6]、简单重复序列间扩增（ISSR）[7]等分子标记都有被应用于荷花亲缘关系分析的报道。此外，薛建华等采用开发的简单重复序列（SSR）标记，建立了荷花品种DNA指纹图谱构建方法[8]。虽然分子标记在荷花资源分类中已有较多应用，但现有报道多见于栽培品种，对野生荷花的系统研究几乎没有。本研究拟采用文献报道多态性较好的SSR引物，对供试的15个野生荷花进行SSR扩增，利用扩增位点信息构建指纹编码，并对这些材料进行非加权组平均法（UPGMA）聚类分析，旨在能够从分子水平对野生荷花材料进行分类和鉴定，为野生荷花亲缘关系研究及分子标记辅助育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的15個野生荷花材料（表1）采集于各地原生境，保存于苏州市农业科学院荷花资源保存圃，采用盆栽方式栽培保存。于2018年清明节前后对所有材料进行翻盘并采用健康的种藕繁殖，同年4月采集植株嫩叶，取样时采用0.5 cm打孔器，在叶片四周、中部各打1孔，每个材料取3张叶片，样本洗净后直接放入离心管用液氮处理，置于-20 ℃冻存。

1.2 DNA的提取与验证

全基因组DNA提取采用经典十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法[9]，提取的DNA样本采用120 V电压1% 琼脂糖凝胶电泳检验。并用Nano drop 2000对DNA的纯度和浓度进行检测，将所提DNA浓度稀释至20 ng/μL，置于 4 ℃保存备用。

1.3 荷花SSR标记

参考Yang等基于我国古代莲全基因组开发的核微卫星（nSSR）引物[10]，选择12对（SSR016、SSR030、SSR040、SSR045、SSR049、SSR064、SSR067、SSR074、SSR088、SSR285、SSR472和SSR482）;参考Tian等筛选的SSR引物[11]，选择2对（Nelumbo13和Nelumbo14）;参考Kubo等筛选的SSR引物[12]，选择1对（ns034）;参考Xue等从莲叶绿体全基因组中开发的单倍标记叶绿体基因组微卫星标记（cpSSR）引物[13]，筛选2对（Lotus12和Lotus17）。一共有15对SSR引物和 2对cpSSR引物（序列信息详见表2）用于野生荷花指纹编码构建及亲缘关系鉴定。正向引物5′端用4种荧光修饰[羧基荧光素（FAM）、六氯-6-甲基荧光素（HEX）、羧基-X-罗丹明（ROX）和羧基四甲基罗丹明（TAMRA）]，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR反应试剂采用TOYOBO公司的KOD-Plus试剂盒。PCR反应体系：10×KOD buffer? 2.5 μL;2 mmol/L dNTPs? 2 μL;25 mmol/L MgSO4 05 μL;10 μmol/L Forward Primer? 1 μL;10 μmol/L Reverse Primer? 1 μL;Template DNA? 1 μL;KOD-Plus 1 U;补水至25 μL。PCR反应参数：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，适宜退火温度（各引物的退火温度见表2）30 s，72 ℃ 30 s 共35个循环;72 ℃延伸 5 min。扩增反应完成后产物置于 4 ℃ 保存备用。

荧光引物扩增后产物利用ABI 3730测序仪进行毛细管电泳，并对毛细管电泳结果采用GeneMarker进行标准化分析，内参大小依次为5111、75.71、100.73、139.81、149.80、160.75、20081、250.78、300.79、340.78、350.78、400.80、450.78、490.82、500.90 bp。

1.4 数据统计分析

统计各引物扩增得到的扩增峰数量，采用人工读取的方法，对照内参在相同迁移位置上，有峰的计为1，无峰的计为0，每个峰相当于1个等位基因位点。使用Excel软件建立供试野生荷花材料与等位基因位点之间的0/1矩阵图，统计每对引物扩增出的总位点数（T）、多态性位点数（N），记录每个位点扩增片段的长度及每对引物扩增的多态性位点百分率（PPL）。PPL计算公式：PPL=（N/T）×100% 。利用Cervus 3.0.7软件计算15对SSR引物的多态性信息含量（PIC）;利用NTSYS 2.0.1软件计算供试材料间的遗传相似性，构建UPGMA聚类图。将15个荷花材料通过不同引物扩增获得的等位基因位点，按照扩增片段长度从小到大的顺序依次用阿拉伯数字编码，位点超过9个以上，用个位数带下划线表示，构建野生荷花指纹编码。

2 结果与分析

2.1 SSR扩增结果

利用筛选的17对引物，对15个野生荷花样本基因组DNA进行扩增，扩增位点数、多态性位点数、PIC见表3。15对SSR引物在15个野生荷花中共扩增位点72个，平均每对引物4.8个，其中多态性位点有72个，PPL为100%。15对SSR引物扩增15个野生荷花的PIC介于0371～0.834之间，平均值为0.605，其中12对SSR引物的PIC大于0.5，说明15个野生荷花材料具备一定的多态性。2对cpSSR引物共检测到9个单倍型位点，平均每对引物4.5个，其中多态性位点8个，PPL为88.9%。引物扩增位点片段的长度有较大差异。SSR引物中，ns034扩增的片段最短，为 102～124 bp，引物SSR088扩增的片段较长，为285～301 bp。此外，cpSSR引物中Lotus12扩增的片段最长，为380～434 bp。

2.2 15个野生荷花材料的遗传差异分析

根据SSR标记位点扩增结果计算15个野生荷花材料之间的遗传相似系数（表4），发现15个材料两两间的遗传相似系数为0.530 9～0.925 9，相似系数平均值为0.676 2，遗传相似系数越大说明材料间的遗传差异越小。南埂野生莲和汶溪红莲的遗传相似系数最小，为0.530 9，说明二者遗传差异较大。同样采集于云南文山普者黑地区的野生荷花普者黑红荷和普者黑白荷之间的遗传相似系数最大，为0.947 4，二者遗传差异最小。对表4中15个野生荷花材料两两间共105个相似系数进行UPGMA聚类分析，结果如图1所示，以遗传相似系数 0.669 6 为依据，可将15个材料分为3个组，其中Ⅰ组有2个野生荷花材料，分别为南埂野生莲和莲湖野生莲;Ⅱ组有6个野生荷花材料，分别为山庙前野生莲、微山湖红莲、东湖红莲、白洋淀红莲、西湖红莲、太湖红莲;Ⅲ组有7个野生荷花材料，分别为清塘野生莲、洞庭湖野生莲、汶溪红莲、济宁野生红莲、普者黑白荷、普者黑红荷、苏州青莲子。由此可见，同省份的荷花并未完全分在一组。

2.3 野生荷花指紋编码的构建

15对SSR二倍体标记共有30位数字，2对cpSSR标记共有2位数字，因此本试验使用的17对引物扩增对应每个野生荷花材料的DNA编码由32位数字组成。将每对引物对15个野生荷花材料扩增获得的所有位点按照片段大小从小到大进行编码，建立编码标准如表5所示。根据该标准，对15个野生荷花的扩增结果进行数据录入，构建15个野生荷花材料的指纹编码（表6），结果显示该方法可以将15个野生荷花材料完全区分开。

3 讨论与结论

荷花是我国重要的经济和观赏作物，在景观布置、水环境治理等方面也有较多的应用。从遗传多样性角度而言，荷花的遗传背景相对狭窄，要利用好荷花满足不同的产业需求，必须充分发掘现有的荷花资源。野生荷花多为单瓣型[14]，与栽培荷花相比，性状相似，观赏性不足，但野生荷花中包含有很多特殊性状，如有学者在云南普者黑地区发现的株型超过3米的野生荷花，为大株型荷花新品种选育提供了非常好的亲本材料[15]。因此，做好野生荷花鉴定工作，对引导荷花育种，尤其是特色荷花育种，全面开发荷花资源具有重要的意义。

要单独采用表型鉴定的方法区分野生荷花材料相对较困难，有报道显示，SSR标记是一种有效、可靠的分子标记，可用于荷花亲缘关系鉴定和指纹图谱的构建[8]。本研究采用前期研究所筛选的17对引物，包括15对SSR引物和2对cpSSR引物，对来源不同的15个野生荷花材料基因组DNA进行扩增，发现15对SSR引物可扩增位点72个，其中多态性位点有72个，PPL为100%;2对cpSSR引物可扩增位点9个，其中多态性位点有8个，PPL为889%。不同来源的野生荷花虽然表型性状相似，但扩增位点多态性比例高，说明其中具有丰富的基因多样性可以被挖掘。UPGMA分析结果显示，15个野生荷花材料互相之间遗传相似系数平均值为0.676 2，说明部分供试的野生荷花材料之间的相似度还是比较高的，其来源可能比较接近。尽管如此，通过SSR标记可以有效地区分15个野生荷花，每种荷花均有其特殊的指纹编码，这为进一步明确野生荷花亲缘关系，将其用于荷花育种提供了基础。

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