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太湖花鳖雌雄群体形态及遗传差异分析

范文

王苗苗　梅肖乐　冯子偃　徐建荣　韩晓磊

摘要：通过多元统计分析和线粒体DNA测序技术，对中华鳖地方特色品种——太湖花鳖雌雄群体的形态和遗传差异进行了分析研究。结果显示，在形态上，对太湖花鳖雌雄群体各项形态参数进行t检验差异分析，发现雄性尾部的生长与其体质量的增加相关显著，呈线性关系;对太湖花鳖雌雄群体形态参数进行主成分分析，并作出主成分1和主成分2的散点图，得出雌雄群体形态差异不明显。对太湖花鳖雌雄群体线粒体D-loop控制区序列进行差异分析，雌雄群体间遗传差异为0.0114;构建N-J聚类系统树，雌雄群体无单独聚类，群体遗传差异不明显。结果表明，太湖花鳖个体形态差异与其性别存在一定程度的相关性，特别是尾部特征，可用于雌雄性别的初步判断，但雌雄群体在外观形态和线粒体DNA上均没有明显差异。

关键词：太湖花鳖;多元统计分析;D-loop控制区;形态差异;遗传差异

中图分类号：S966.5文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2021）01-0142-04

作者简介：王苗苗（1987—），女，江苏南京人，硕士，水产工程师，主要从事水生生物学研究和水产技术推广工作。E-mail：miaomiaotgz@163.com。

通信作者：韩晓磊，硕士，高级实验师，从事淡水水生生物学研究。E-mail：84125241@qq.com。

多元统计分析可根据形态特征的多个参数，对多个互相关联的指标和对象进行统计分析以揭示其规律，符合农业科学的研究特征[1]。目前，多元统计分析已在水生动物的物种种质评定、种群遗传变异、性别差异分析等领域开展了大量的研究，然而对龟鳖类物种的研究还鲜有报道[2-6]。线粒体DNA作为细胞中遗传信息的重要载体，具有长度短、含量高、进化速度快和母性遗传等特点，特别是D-loop控制区，因其不编码蛋白，承受选择压力较小，是线粒体DNA中进化最快的部分，已成为水生动物种类鉴定、遗传多样性、遗传变异、系统进化、性别差异等方面的研究热点[7-13]。

太湖花鳖属于中华鳖（Trionyxsinensis）的地方特色品种，主要分布于长江中下游，太湖流域居多，与普通中华鳖体色差异较大，特别是在自然状态下体色油绿，背部有对称小圆黑斑，腹部有明显块状灰黑花斑，由此得名;并因其较高的营养价值和良好的口感风味受到人们青睐，江南地区多有养殖，市场前景广为看好。太湖花鳖雌雄体在形态规格及生长特性上存在一定差异，本研究通过多元统计分析和线粒体D-loop控制区分析，于表型和基因型多方面对太湖花鳖雌雄特征予以揭示，以期为太湖花鳖雌雄鉴别，以及种质鉴定、资源保护和利用提供一定的理论支持。

1材料与方法

1.1材料来源

太湖花鳖样品是在2017—2018年取自太湖常州武進段的野生群体，共计取样30只，其中，雌雄各半，试验于2019年在长江特色水产工程技术研究中心完成。太湖花鳖活体用于形态参数统计分析，之后取样品腿部肌肉组织于-70℃冰箱中保存，以备提取DNA使用。

[FK（W11][TPWMM11.tif;S+3mm][FK）]

1.2形态参数测量

游标卡尺测量每尾太湖花鳖的体高、头长和头宽等16项形态指标（精度为0.1mm），电子天平测量每尾太湖花鳖的体质量（精度为0.1g），具体测量方法参考国家标准（GB2104—2007）[14]，具体指标见表1、表2。鉴于活体太湖花鳖不便于测量，故可将其放入密闭容器，进行乙醚吸入式麻醉后方可精确测量。

1.3D-loop控制区的PCR扩增及测序

参照韩晓磊等的研究方法[15]提取太湖花鳖样品基因组DNA并检测其完整性，测定其浓度后于-20℃保存备用。太湖花鳖2对扩增D-loop控制区的引物序列分别为：T1（5′-3′）：[JP9]ATCTTACCCCTACTACACACAT;T2（5′-3′）：[JP9]AGACTGGTGATGGAGTATC;T3（5′-3′）：[JP9]GCCACAATACTTGTTTATCT;T4（5′-3′）：[JP9]AATATCCATCTTGGCGTCTTCA。PCR扩增反应参见陆文浩等的方法[16]具体操作，并测得太湖花鳖样品线粒体DNA序列。

1.3数据处理

1.3.1形态参数分析

试验数据采用SPSS19.0软件进行分析，本研究多元分析方法包括t-检验和主成分分析，它们是针对多个研究对象同时进行分析所得数据的运算方法。通过将背甲长作为基数，以取得2个形态参数比值，从而消除鳖体规格大小对多元分析中参数值的影响。

1.3.2D-loop控制区序列分析

所获得太湖花鳖D-loop控制区序列经过校对处理后，采用软件ClustalX2.1和MEGA5.1进行序列比对和分析，通过Kimura双参数模型统计雌雄群体群间遗传差异，运用邻接法构建系统发生树，以bootstrap进行检验，重复1000次。

2结果与分析

2.1形态差异分析

由表1可知，太湖花鳖雄鳖体质量与尾长关系的r=0.662（r>r0.01），尾部生长与体质量增加相关性显著，其一元线性回归方程为：Y体质量=44.473X尾长+115.837，回归显著性检验F=10.143，F>F0.01;太湖花鳖雌鳖体质量与尾长关系的r=0.445（r

2.2主成分分析

由表2可知，太湖花鳖雌雄群体方差贡献率较高的4个主成分贡献率分别为43.163%、14.427%、8.812%和8.600%，其累积贡献率为75.003%，包含了群体总变异的大部分，可见以上4个相互独立的主成分可代表太湖花鳖雌雄群体间的形态差异。在主成分1中，变量X2、X3、X4、X6、X7、X8、X9、X12和X13影响最大;在主成分2中，变量X10、X11和X14影响最大;在主成分3和主成分4中，变量X2影响最大。背甲周长、背甲宽、腹甲长、腹甲宽和尾长是主成分1变异贡献的主要形态指标，可见太湖花鳖鳖体长度、宽度和尾长是引起其雌雄群体形态差异的主要指标。

由图2可知，太湖花鳖雌雄群体主成分1和主成分2为相对值，雌雄群体之间存在部分重叠，主成分1和主成分2不能准确将雌雄群体进行区分，故太湖花鳖雌雄群体总体形态差别较小，形态差异统计分析较难将其准确鉴别。

2.3D-loop控制区序列分析

2.3.1太湖花鳖线粒体D-loop控制区序列比较

测序所得序列与GenBank中序列号为AY687385.1的中华鳖线粒体DNA序列进行Blast同源性比对，证实所测序列位于第15321位到15835位之间，大小为515bp，碱基组成分别为G、C、T和A的碱基平均含量分别为10.0%、30.0%、32.9%和27.1%，其中T+A含量（60.0%）高于G+C含量（40.0%），是线粒体DNA典型的反G偏倚特征。太湖花鳖雌雄群体的群内遗传相似度为99.23%。

2.3.2太湖花鳖分类地位鉴定

根据D-loop控制区序列差异，用MGEA5.1分析2个群体的遗传距离，由图3可知，发现雌雄群体间遗传差异为0.0114。构建聚类系统发生树，太湖花鳖雌雄群体混为一体，群内个体无单独聚类。

3讨论

t检验是用于小样本（样本容量小于30）的2个平均值差异程度的检验方法，它是用T分布理论来推断差异发生的概率，从而判定2个平均数的差异是否显著[17-18]。本研究中，太湖花鳖雄性尾巴的生长与其体质量的增加显著相关，可用于太湖花鳖雌雄性别的鉴别;主成分分析中尾长也是引起形态差异的主成分变量之一，且需与其他形态变量共同作用进行差异分析。珠水对中华鳖性别鉴别方法进行了研究，指出雄性中华鳖较之雌性尾巴较长，大多能自然伸出裙边外，故尾部特征可以作为雌雄判别的重要依据[19]，此结论与本研究结果基本一致。然而，在太湖花鳖雌雄群体30个样本的散点图分析结果中，太湖花鳖雌雄群体并没有明显区分。以上推斷表明，太湖花鳖个体形态差异与其性别存在一定程度的相关性，特别是尾部特征，可用于雌雄性别的初步判断，但其群体的形态差异并不明显，还需更多的参数乃至更深入的分析研究予以揭示。

本研究通过线粒体D-loop控制区序列比对差异分析，发现太湖花鳖雌雄群体群间遗传差异仅为0.0114，可以认为2个群体间不存在有效遗传差异。太湖花鳖雌雄群体聚类系统发生树中2个群体的群内个体未按照性别差异单独聚类，同样揭示雌雄群体群间遗传差异并不明显。

综上所述，太湖花鳖雌雄群体在外观形态上可通过尾巴长短进行简单区分，但进行准确的分辨还相对较难，线粒体DNA差异同样不明显。由此推断，太湖花鳖雌雄群体差异在外观形态只有微小的体现，而在水产养殖中，雄鳖生长速度快于雌鳖，成熟的雄性个体比雌性大且一般为雌性的3倍左右[17]，揭示太湖花鳖雌雄差异可能主要体现在生长速度上，故体质量的变化可作为研究方向。

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