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利用SSR标记分析江苏水稻联合体试验品系遗传多样性

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吴锦泉张小强胡忠磊

摘要：选育和推广优良水稻品种对于保障我国粮食安全具有深远影响，研究水稻种质资源遗传多样性对水稻的选育和利用具有重要的指导价值。本研究采用“江苏省水稻品系真实性SSR标记方法”中60个对江苏水稻品种具有良好特异性的SSR分子标记，对2019年江苏省水稻联合体试验中共计256个品系进行了遗传多样性分析。结果表明，在256个试验品系中共检测到271个等位基因，每个标记的多态性片段的均值为4.52个，其变异范围在1～8，PIC值为0.41;256个品系遗传相似系数在0.32～1，平均相似系数为0.59，其中40.4%的遗传相似系数>0.6，说明这些供试品系亲缘关系较近。研究结果将为水稻品种遗传多样性的鉴定以及水稻育种的遗传改良提供科学依据。

关键词：水稻品系;遗传多样性;SSR标记;聚类分析

中图分类号：S-3 ? ? ? 文献标识码：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20201030009

农作物种质资源是保障农业生产稳定的基础，也是人类未来生存和发展的先决条件，其在农业科学和生命科学研究领域中占有极为重要的地位[1]。在生物体的长期进化中，基因突变和重组导致了自然有性生殖的2个个体后代产生与亲本不相同的基因型，如何鉴别后代在外观与亲本类似的情况下是否产生这种遗传变异是值得研究的问题。物种的种质资源遗传多样性可以用来发现和用于改良现有品种以及创新新种质。水稻、小麦和玉米是中国3种主要粮食作物，我国超过1/2的人口以大米为主食，江苏省的气候、地理环境适宜水稻生长，也是我国水稻主要分布地区之一，江苏省水稻品种遗传多样性的调查和了解对于优质水稻品种选育具有积极作用。

对植物品种特异性、一致性和稳定性测试是保护新品种的技术基础和科学依据[2，3]，该测试主要在于田间种植鉴定，根据品种田间表型差异来判定新品种是否有别于亲代[4]，但周期长、容易受到环境影响、工作量大等。随着新品种数量的增多，該测试技术已经难以在实践中进行，鉴定结果严重滞后，甚至会对执法效率产生严重影响[5]。而DNA指纹图谱技术的出现解决了这一难题，指纹图谱技术是基于DNA分子标记鉴别生物个体差异的DNA电泳图谱，主要包括基于AFLP、RFLP、RAPD、SSR、SNP等标记的指纹技术[6]，具有多态性高、特异性强并且能够稳定遗传等特点，其中SSR和SNP标记最为常用。SSR标记是由Tautz等[7]提出，技术优点有操作简单、重复性好、共显性[8];在短时期内，农作物进行品种鉴定的主要方法就是采用SSR标记法。研究结果可以了解DNA水平上种质之间的遗传关系并表现出基因型差异。将DNA指纹检测技术应用于作物DUS测试实践，有助于规范种业市场，对保护我国丰富的种质和基因资源、保障我国农业生产及粮食安全具有重要意义。

遗传多样性研究是种质资源工作的基础，也是遗传演化研究和育种的理论基础，对于发掘控制重要农艺性状相关基因以及育种实践均具有较强的参考价值和指导意义[9]。本研究采用60个对江苏水稻品种具有良好特异性的SSR分子标记，分析了2019年江苏省水稻联合体供试的269份品系的遗传多样性。研究结果对江苏省水稻参试品系之间的遗传多样性得以更深入地了解，为以后水稻育种中的亲本材料的选配提供参考依据。

1 试验材料和方法

1.1 材料

试验材料是2019年江苏省水稻联合体试验参试品系，来自11个联合体19组试验，根据试验生态类型划分，可分为以下试验组：早熟晚粳组49份，中熟中粳组103份，迟熟中粳组117份，共计269份。其中，10个品系区试生试同步（同名品系2个样品），3个品系有食味品尝样品（同名品系参试）。分子标记用《江苏水稻品种真实性鉴定SSR标记法》中对江苏水稻品种特异性较好的60个SSR标记。

1.2 方法

1.2.1 秧苗栽插管理

试验在扬州大学实验农牧场进行，2019年5月5日播种，1个月后将培育好的水稻秧苗移栽至大田，单株栽插，每个品系栽插4行，每行12株，共48株。秧苗成长期间田间正常进行病虫害的防治及肥水管理。

1.2.2 DNA的提取

水稻秧苗移栽大田14d后，用CTAB法提取叶片基因组DNA。剪取各品种随机种植的幼嫩叶片提取总DNA。

1.2.3 PCR扩增与聚丙烯酰胺凝胶电泳

PCR是用于放大扩增特定DNA片段的分子技术，PCR扩增反应体系为DNA（20ng·μL-1）2μL，10×PCRbuffer2μL，25mmol·L-1MgCl22μL，10μmol·L-1前引物0.4μL，10μmol·L-1后引0.4μL，10mmol·L-1dNTPs0.4μL，5U·μL-1Taq酶0.2μL。PCR扩增程序为94℃预变性5min，94℃变性30～45s，50～60℃退火45s，72℃延伸30s，72℃延伸8min，10℃保温30min，35个循环。

PCR扩增产物采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离检测（150V、200A），电泳结束后采用硝酸银染色7min，蒸馏水漂洗2次，显影液显色至带型清晰，用双蒸水冲洗2遍，沥干，封胶，拍摄成像，最后读胶并进行赋值。

1.3 数据统计分析

按照“0、1”赋值法[10]将胶进行赋值，供试品系的标记对比标准带型在相同位置上有带的记为“1”，无带的记为“0”，并做好数据记录工作，计算生物多态信息含量[11]：

PICi=1∑ni=1p2ij

式中，pij表示标记i的第j个等位基因在群体中的分布频率，标记i的总等位基因数从j=1～n。运用R语言计算269个参试品系两两间的遗传相似系数，利用遗传相似系数矩阵，用最小离差平方和法进行聚类分析并作图。

2 结果与分析

2.1 269份参试品系在60对SSR引物下的多态性分析

用60对SSR引物对269份参试品系进行PCR扩增，然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，图1所示为以RM1195引物扩增的部分参试品系的电泳检测结果，参试品系前是一个Marker作为标记，以方便对比片段大小，并且加入了引物所对应的标样（参照品种）以检测参试品系和标样之间是否有差别。

采用上述方式，用60对SSR引物分别对269个参试品系进行检测，269个参试样品中，13个同名品系DNA指纹相同，农艺性状考察表型也一致，说明本试验检测结果准确。整理好数据后，将检测出的等位基因数与多态性信息含量（PIC）进行计算和统计（见表1）（由于269个检测样品中有13个是同名品系，后续计算、表述均基于256个样品）。在256份参试品系中共检测到271个等位基因，每个标记多态性片段的均值是4.52个，其变异范围在1～8个，其中2～7个的多态性片段占据比例为91.7%，表明60对SSR引物在参试品系中有较好多态性。

多態性信息含量是反映被测品系之间SSR标记变异程度和SSR标记效率的指标，检测到等位基因数量越多，PIC值越大，或等位基因频率越高，PIC值越大;反之，PIC值越小。PIC值>0.5，多态性较高;0.25≤PIC值≤0.5，多态性适中;PIC值<0.25，多态性较低[12]。对60对引物的PIC值进行了计算和统计（见表1）。结果表明，参试的256个品系的平均PIC值为0.41，变化范围在0～0.76。引物RM274仅检测到1个等位基因，PIC为0;引物RM21检测到9个等位基因，PIC为0.76。有45个SSR标记的PIC值≥0.25，占75%;有25个SSR标记的PIC值>0.50，占42%。进一步说明这60个SSR标记在参试品系中具有良好多态性。

2.2 遗传相似性分析

遗传相似性系数用来表示2个品种间的亲缘关系的远近，数值越高，亲缘关系越近;反之，则越远。利用60对SSR标记位点上256个品系的分配信息，使用R语言进一步估算了256个品系之间的相互遗传相似性系数，256个参试品系相互遗传相似性系数介于0.32～1，平均0.59，相互遗传相似性系数在0.6以上的占比40.4%，说明这些品系总体来说亲缘关系较近。其中有3组品系，遗传相似系数为1，说明其尽管名称不同，实质是同一个品系;亲缘关系较远的2个品系是“保丰805”和“镇稻9503”，之间的遗传相似系数仅0.32。部分参试品系间的遗传相似系数见表2。

利用遗传相似系数矩阵进行聚类分析（见图2），发现以生育期为主划分的同一生态类型品种（根据试验组别确定）并没有被更多聚在一起的迹象，说明品系之间的亲缘关系与生育期并不密切，更多的可能还是与品系育成单位的亲本选配有关。

3 小结与讨论

利用在江苏水稻品种特异性较好的60个SSR标记对2019年江苏的256份水稻品系进行遗传多样性分析，结果表明，参试的256个品系的平均PIC值为0.41;有45个SSR标记的PIC值≥0.25，占比75%;有25个SSR标记的PIC值>0.50，占比42%;进一步说明这60个SSR标记在参试品系中多态性良好。参试品系的平均遗传相似性系数为0.59，遗传相似性系数在0.6以上的占比40.4%，说明这些品系总体来说亲缘关系较近。其中也发现极端类型的3组品系，遗传相似系数为1，实质是同质不同名品系参试。

从对256份材料研究结果表明，江苏省水稻新品系间的遗传多样性可能并不丰富，远距离地区之间的基因交流和优良基因的挖掘仍然有待提高。因此，在未来育种工作中，育种工作者仍需多多收集其它水稻品种丰富地区的优良种质资源，增加引进外来品种，掌握所选亲本的遗传多样性，创新育种方法，培育优质水稻品种。

参考文献

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（责任编辑周康）

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