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标题	一种微孔板法检测食品中添加维生素B12含量的方法
范文	高利海 维生素B 12（V B 12），又称钴胺素（Cobalamin），是人体中非常重要的水溶性维生素之一，主要用于婴幼儿奶粉、谷物食品、保健食品、乳品和功能性饮料等食品中营养强化。目前针对食品中B12检测方法，国标有GB 5009.217《保健食品中维生素B12测定》、GB 5413.14《婴幼儿食品和乳品中维生素B12测定》，但由于食品成分复杂、存在多种干扰因素，因此化学分析法的应用受到限制，目前国际仍以微生物法作为首选方法。 虽然微生物法检测VB12具有较高的灵敏度和精确度，但GB5413.14方法，步骤繁琐、操作耗时、检测周期长、易受外部因素干扰等诸多问题。本文采用德国拜发公司微孔板法对婴幼儿配方奶粉、谷物米粉、含乳饮料、功能饮料等食品中添加VB12含量的测定，实验稳定性非常好。 材料与方法 材料与仪器：VitaFast Vitamin B12试剂盒（德国拜发P1002）、微量移液器20- 200μl；100- 1000μl（eppendorf）、50ml离心管，2.0 ml EP管、一次性无菌注射器（带0.2μm无菌滤膜）（Axygen）；生物安全柜（赛默飞世尔1374）、酶标仪（BioTek Instruments ELX808）、恒温培养箱（精宏GNP- 9270）、电热恒温水浴锅（精宏DK-8D） 实验方法。 （1）样品处理：称取1g（ml）样品（精确至0.001g），加40 ml的无菌蒸馏水溶解，放于50 ml带盖离心管中，于95℃水浴锅保温30min，期间至少摇晃4- 5次。迅速放于4℃冰箱冷却至30℃以下，用无菌注射器吸取样品过滤0.45μm滤膜，取所需样品于2 ml离心管，稀释至所需倍数。 （2）制备标准溶液：表1为标准溶液的稀释梯度。按照说明书向B12标准品干粉的小瓶内加入适量无菌水，混匀。按表1顺序加无菌水、标准品和测定用培养基于2ml EP管，一式3份。测定培养基按照说明书加10ml无菌水，摇匀，95℃水浴5 min，期间振荡至少5次，迅速放于4℃冰箱冷却至30℃以下，用0.45um滤膜过滤待用。 （3）样品检测：取出所需微孔板条固定于板上，先加150ul培养基至各微孔中，然后依次加150 ul的标准品和样品至各微孔中，一式三份。用粘合箔盖住板条和微孔，用手将粘合箔平压，使其充分封闭微孔板条。 （4）培养：3 7℃黑暗条件下培育44h- 48h。 （5）测定：将微孔板倒置桌面上，振荡，使微生物溶解于培养基中。然后将微孔板翻回前置于桌面上，从对角线方向轻扯下粘合箔，务必另一只手按压放置在桌面上的微孔板，以防止粘合过紧撕扯带起微孔板。用酶标仪630nm条件下读取数值。 结果与分析 绘制标准曲线：以维生素B12含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。如图1，试剂盒标准曲线在0.03- 0.18ug/100g范围内线性均良好，相关系数为1，检测限可达到0.03ug/100g 重复性：选取配方乳粉（2份）、配方米粉、含乳饮料、功能饮料为试验样品，每个样品作6次平行试验，测试结果见表2，5种样品6次平行测试的RSD在3.9%- 6.9%之间，说明重复性良好。 加标回收率：选择已知维生素B12含量的标准品加入同一乳粉中，加标量分别为250.0ng，150.0ng，100.0ng，进行3次重复试验，结果如表3，回收率为94.2%- 100.8%，试验灵敏度较高。 小结与讨论 应用微生物法检测维生素B12，其准确度与灵敏度取决于试验中乳杆菌数量、活力、培养基、样品处理方式以及人员操作等因素。商品化试剂盒通过一定工艺水平将菌株固定在微孔板上，减少菌株活力、培养基等造成的误差，但操作中仍需要注意，1.标准曲线的绘制直接影响实验结果，因为微生物生长是非线性的，随着VB12浓度增加，吸光度的增长渐缓慢；2.使用Ridawin数据处理软件，采用多項式曲线拟合法绘制标准曲线更符合菌株的实际生长情况；3.需无菌操作，移液器枪头、离心管、过滤膜等需提前灭菌，以避免外来微生物的污染。本文采用微孔板法测试5种食品添加的VB12，定量限在0.03- 0.18ug/100g（ml）范围内线性良好，相关系数为1，重复性试验中，样品的平行性较好，相对标准偏差在3.9% - 6.9%，加标回收率在94.2% -100.8%，相对繁琐的国标方法，微孔板法是一种操作简单、快捷、准确度和重复性良好，适合各实验室推广应用。
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